Nature.com ପରିଦର୍ଶନ କରିଥିବାରୁ ଧନ୍ୟବାଦ |ସୀମିତ CSS ସମର୍ଥନ ସହିତ ଆପଣ ଏକ ବ୍ରାଉଜର୍ ସଂସ୍କରଣ ବ୍ୟବହାର କରୁଛନ୍ତି |ସର୍ବୋତ୍ତମ ଅଭିଜ୍ଞତା ପାଇଁ, ଆମେ ପରାମର୍ଶ ଦେଉଛୁ ଯେ ଆପଣ ଏକ ଅପଡେଟ୍ ବ୍ରାଉଜର୍ ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ (କିମ୍ବା ଇଣ୍ଟରନେଟ୍ ଏକ୍ସପ୍ଲୋରରରେ ସୁସଙ୍ଗତତା ମୋଡ୍ ଅକ୍ଷମ କରନ୍ତୁ) |ଏହା ସହିତ, ଚାଲୁଥିବା ସମର୍ଥନ ନିଶ୍ଚିତ କରିବାକୁ, ଆମେ ଶ yles ଳୀ ଏବଂ ଜାଭାସ୍କ୍ରିପ୍ଟ ବିନା ସାଇଟ୍ ଦେଖାଇଥାଉ |
ସ୍ଲାଇଡ୍ ପ୍ରତି ସ୍ଲାଇଡ୍ ତିନୋଟି ଆର୍ଟିକିଲ୍ ଦେଖାଉଛି |ପ୍ରତ୍ୟେକ ସ୍ଲାଇଡ୍ ଦେଇ ଗତି କରିବା ପାଇଁ ସ୍ଲାଇଡ୍ କିମ୍ବା ଶେଷରେ ସ୍ଲାଇଡ୍ କଣ୍ଟ୍ରୋଲର୍ ବଟନ୍ ବ୍ୟବହାର କରିବାକୁ ପଛ ଏବଂ ପରବର୍ତ୍ତୀ ବଟନ୍ ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ |
ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟକରଣ
310 10 * 1 ମିମି ଷ୍ଟେନଲେସ୍ ଷ୍ଟିଲ୍ କୋଇଲ୍ ଟ୍ୟୁବ୍ ଯୋଗାଣକାରୀ |
| ଗ୍ରେଡ୍ | 301, 304, 304L, 316, 316L, 309 S, 310, 321 |
| ମାନକ | ASTM A240, JIS G4304, G4305, GB / T 4237, GB / T 8165, BS 1449, DIN17460, DIN 17441 |
| ମୋଟା | | 0.2-10.0 ମିମି |
| ମୋଟେଇ | 600 ମିମି ମିନିଟ୍ | |
| ଦ Length ର୍ଘ୍ୟ | | 2000mm-8000mm କିମ୍ବା ଗ୍ରାହକଙ୍କ ଅନୁରୋଧ ଭାବରେ | |
| ପୃଷ୍ଠଭୂମି ଶେଷ | NO1, No.4,2B, BA, 6K, 8K, PVC ସହିତ କେଶ ରେଖା | |
ରାସାୟନିକ ରଚନା |
| ଗ୍ରେଡ୍ | C | Si | Mn | P≤ | S≤ | Cr | Mo | Ni | ଅନ୍ୟମାନେ | |
| 301 | ≤0.15 | ≤1.00 | ≤2.00 | 0.045 | 0.03 | 16-18 | - | 6.0 | - |
| 304 | ≤0.07 | ≤1.00 | ≤2.00 | 0.035 | 0.03 | 17-19 | - | 8.0 | - |
| 304L | ≤0.075 | ≤1.00 | ≤2.00 | 0.045 | 0.03 | 17-19 | - | 8.0 | |
| 309S | ≤0.08 | ≤1.00 | ≤2.00 | 0.045 | 0.03 | 22-24 | - | 12.0 | - |
| 310 | ≤0.08 | ≤1.5 | ≤2.00 | 0.045 | 0.03 | 24-26 | - | 19.0 | - |
| 316 | ≤0.08 | ≤1.00 | ≤2.00 | 0.045 | 0.03 | 16-18.5 | 2 | 10.0 | - |
| 316L | ≤0.03 | ≤1.00 | ≤2.00 | 0.045 | 0.03 | 16-18 | 2 | 10.0 | - |
| 321 | ≤0.12 | ≤1.00 | ≤2.00 | 0.045 | 0.03 | 17-19 | - | 9.0 | Ti≥5 × C |
ଯାନ୍ତ୍ରିକ ଗୁଣ |
| ଗ୍ରେଡ୍ | YS (Mpa) ≥ | TS (Mpa) ≥ | ଏଲ୍ (%) ≥ | କଠିନତା (HV) ≤ |
| 301 | 200 | 520 | 40 | 180 |
| 304 | 200 | 520 | 50 | 165-175 |
| 304L | 175 | 480 | 50 | 180 |
| 309S | 200 | 520 | 40 | 180 |
| 310 | 200 | 520 | 40 | 180 |
| 316 | 200 | 520 | 50 | 180 |
| 316L | 200 | 480 | 50 | 180 |
| 321 | 200 | 520 | 40 | 180 |
ରେକମ୍ବିନାଣ୍ଟ ସ୍ପାଇଡର୍ ରେଶମ ପ୍ରୋଟିନ୍ (ସ୍ପାଇଡର୍ ରେଶମ ପ୍ରୋଟିନ୍) ର ନୂତନ ଜ om ବ ପଦାର୍ଥର ବିକାଶରେ ଅନେକ ସମ୍ଭାବ୍ୟ ପ୍ରୟୋଗ ଅଛି, କିନ୍ତୁ ସେମାନଙ୍କର ମଲ୍ଟିମୋଡାଲ୍ ଏବଂ ଏଗ୍ରିଗେସନ୍ ପ୍ରବଣ ପ୍ରକୃତି ସେମାନଙ୍କୁ ପାଇବା କଷ୍ଟକର ଏବଂ ବ୍ୟବହାର କରିବା ସହଜ କରିଥାଏ |ଏଠାରେ ଆମେ ରିପୋର୍ଟ କରୁ ଯେ ରେକମ୍ବିନାଣ୍ଟ ମିନିଏଚର୍ ସ୍ପିଡ୍ରୋଏନ୍ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଏବଂ ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ କଥା ହେଉଛି, N- ଟର୍ମିନାଲ୍ ଡୋମେନ୍ (NT) ନିଜେ ଶୀଘ୍ର 37 ° C ରେ ସ୍ supporting ୟଂ ସହାୟକ ଏବଂ ସ୍ୱଚ୍ଛ ହାଇଡ୍ରୋଜେଲ ଗଠନ କରେ |NT ଏବଂ ସବୁଜ ଫ୍ଲୋରୋସେଣ୍ଟ୍ ପ୍ରୋଟିନ୍ କିମ୍ବା ପ୍ୟୁରିନ୍ ନ୍ୟୁକ୍ଲିଓସାଇଡ୍ ଫସଫୋରାଇଲେଜ୍ ସହିତ ଫ୍ୟୁଜନ୍ ପ୍ରୋଟିନ୍ ସଂପୂର୍ଣ୍ଣ କାର୍ଯ୍ୟକ୍ଷମ ଫ୍ୟୁଜନ୍ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଗଠନ କରେ |ହାଇଡ୍ରୋଜେଲଗୁଡିକ |ଆମର ଫଳାଫଳ ଦର୍ଶାଏ ଯେ ରେକମ୍ବିନାଣ୍ଟ NT ଏବଂ ଫ୍ୟୁଜନ୍ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଉଚ୍ଚ ଅଭିବ୍ୟକ୍ତି ଅମଳ ପ୍ରଦାନ କରେ ଏବଂ ହାଇଡ୍ରୋଜେଲ୍କୁ ଆକର୍ଷଣୀୟ ଗୁଣ ସହିତ ପ୍ରଦାନ କରେ ଯେପରିକି ସ୍ୱଚ୍ଛତା, କ୍ରସ୍ ଲିଙ୍କ୍ ବିନା ଜେଲେସନ୍ ଏବଂ ଉଚ୍ଚ ସାନ୍ଦ୍ରତାରେ ସକ୍ରିୟ ପ୍ରୋଟିନର ପ୍ରତ୍ୟକ୍ଷ ଇମୋବାଇଲାଇଜେସନ୍ |
ସ୍ପାଇଡର୍ ଗୁଡିକରେ ସାତୋଟି ଭିନ୍ନ ଭିନ୍ନ ରେଶମ ଗ୍ରନ୍ଥି ଅଛି, ପ୍ରତ୍ୟେକ ଏକ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ପ୍ରକାରର ରେଶମ ଉତ୍ପାଦନ କରନ୍ତି |ସମସ୍ତ ସାତଟି ରେଶମ ପ୍ରଜାତି ସ୍ପାଇଡର୍ ରେଶମ ପ୍ରୋଟିନ୍ (ସ୍ପିଡ୍ରଏନ୍) ର ପ୍ରାୟ 6000 ଅବଶିଷ୍ଟାଂଶକୁ ନେଇ ଗଠିତ ଏବଂ ଏକ ବୃହତ କେନ୍ଦ୍ରୀୟ ପୁନରାବୃତ୍ତି ଅଞ୍ଚଳ ଧାରଣ କରିଥାଏ ଯାହାକି ଗୋଲାକାର N- ଏବଂ C- ଟର୍ମିନାଲ୍ ଡୋମେନ୍ (NT ଏବଂ CT) 1,2 ଦ୍ୱାରା ଘେରି ରହିଥାଏ |ବହୁଳ ଭାବରେ ଅଧ୍ୟୟନ କରାଯାଉଥିବା ରେଶମ, ପ୍ରାଥମିକ ଆମ୍ପୁଲା, ପ୍ରାଥମିକ ଆମ୍ପୁଲା ଗ୍ରନ୍ଥି ଦ୍ୱାରା ଉତ୍ପନ୍ନ ହୁଏ |ଏହି ଗ୍ରନ୍ଥିରେ, ଏପିଥେଲିଆଲ୍ କୋଷଗୁଡିକର ଏକ ଏକାକୀ ସ୍ପିଡ୍ରୋଏନ୍ ପ୍ରୋଟିନ୍ ସିନ୍ଥାଇଜ୍ କରି ଗ୍ରନ୍ଥିର ଲ୍ୟୁମେନରେ ଗୁପ୍ତ ରଖନ୍ତି, ଯେଉଁଠାରେ ସେମାନେ ଅତ୍ୟଧିକ ଦ୍ରବ୍ୟରେ (30-50% w / v) 3,4 ରେ ଏକ ଦ୍ରବୀଭୂତ ଫର୍ମରେ (ଡୋପିଂ) ଉପସ୍ଥିତ |ଗ୍ରନ୍ଥିରେ ଥିବା ମୁଖ୍ୟ ଆମ୍ପୁଲାର ସ୍ପିଡ୍ରୋଏନ୍ ପ୍ରୋଟିନଗୁଡିକର ସଂଗଠନ ଏବଂ ରୂପାନ୍ତର ବିଷୟରେ ବିତର୍କ ହୋଇଛି, କିନ୍ତୁ ଅଧିକାଂଶ ପରୀକ୍ଷାମୂଳକ ପ୍ରମାଣ ସାଧାରଣତ hel ହେଲିକାଲ୍ ଏବଂ / କିମ୍ବା ରାଣ୍ଡମ୍ ହେଲିକାଲ୍ କନଫର୍ମେସନ୍ ଏବଂ ମାଇକେଲାର୍ କିମ୍ବା ଲାମେଲାର୍ ଷ୍ଟ୍ରକଚରଗୁଡିକର ଉପସ୍ଥିତି ସୂଚାଇଥାଏ 5,6,7,8,9,10 |ପୁନରାବୃତ୍ତି ଡୋମେନଗୁଡିକ ରେଶମ ତନ୍ତୁର ଯାନ୍ତ୍ରିକ ଗୁଣକୁ ନିୟନ୍ତ୍ରିତ କରୁଥିବାବେଳେ β- ସିଟ୍ ନାନୋକ୍ରିଷ୍ଟାଲ୍ ଏବଂ ଆମୋରଫସ୍ ଗଠନ 11,12,13,14,15 ଗଠନ କରେ, ଶେଷ ଡୋମେନ୍ଗୁଡ଼ିକ ରେଶମ ଗ୍ରନ୍ଥିରେ ପରିବର୍ତ୍ତନ ସ୍ଥିତିକୁ ଦୃଷ୍ଟିରେ ରଖି ରେଶମ ତନ୍ତୁକୁ ନିୟନ୍ତ୍ରିତ କରେ 16,17,18 |ରେଶମ ଗଠନକୁ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ କରି, 19. ଟର୍ମିନାଲ୍ ଡୋମେନଗୁଡିକ ବିବର୍ତ୍ତନ ଭାବରେ ସଂରକ୍ଷିତ ଏବଂ ସେମାନଙ୍କର କାର୍ଯ୍ୟ ସମସ୍ତ ସ୍ପିଡ୍ରୋଏନ୍ ପ୍ରୋଟିନ୍ ପାଇଁ ସାଧାରଣ ହୋଇପାରେ 2,20,21 |ଗ୍ରନ୍ଥି ଦେଇ ଗତି କରିବା ସମୟରେ, ସ୍ପାଇଡ୍ରଏନ୍ର pH ପ୍ରାୟ 7.6 ରୁ <5.716 କୁ ହ୍ରାସ ହୁଏ ଏବଂ ଧୀରେ ଧୀରେ ସଂକୀର୍ଣ୍ଣ ନଳୀ ଦେଇ ଗତି ଦ୍ media ାରା ମଧ୍ୟସ୍ଥତା ଦ୍ ar ାରା ମଧ୍ୟଭାଗ ଏବଂ ଷ୍ଟ୍ରେଚ୍ ସହିତ ବୃଦ୍ଧି ହୁଏ |ସମାଧାନରେ, CT ହେଉଛି ଏକ α- ହେଲିକାଲ୍ ଗଠନକାରୀ ସମାନ୍ତରାଳ ଡାଇମର୍ 17, କିନ୍ତୁ କମ୍ pH ଏବଂ ଶିଅର୍ ଫୋର୍ସର ପ୍ରତିକ୍ରିୟାରେ, CT ଖୋଲିବ β- ସ୍ତର 16, 17, ସମ୍ଭବତ Con କନଭର୍ଟ 16 ର ପୁନରାବୃତ୍ତି ଅଞ୍ଚଳରେ β- ସ୍ତରଗୁଡିକ ଟ୍ରିଗର କରିପାରେ | ଗ୍ରନ୍ଥିର ଲ୍ୟୁମେନରେ ସ୍ଥିତିକୁ ପ୍ରତିଫଳିତ କରୁଥିବା ଏବଂ ସ୍ପାଇଡ୍ରଏନ୍ର ଦ୍ରବଣରେ ମଧ୍ୟସ୍ଥତା, କିନ୍ତୁ ହ୍ରାସ ହୋଇଥିବା pH ରେ, ଅନେକ କାର୍ବକ୍ସିଲିକ୍ ଏସିଡ୍ ପାର୍ଶ୍ୱ ଶୃଙ୍ଖଳର ପ୍ରୋଟୋନେସନ୍ ପ୍ରାୟ 6.5 pKa ସହିତ NT ର ଡାଇମେରାଇଜେସନ୍ କରିଥାଏ, ଯାହା ଦ୍ N ାରା NT ସ୍ଥିର ହୋଇ ସ୍ପାଇଡ୍ରଏନ୍ ସ୍ଥିର ହୁଏ | ପରିମାଣନେଟୱର୍କ 16,18।ଏହିପରି, ଆବରଣରେ ଥିବା ଏକ ମୋନୋମରରୁ ଫାଇବରରେ 23,24,25 ରେ ପରିବର୍ତ୍ତନ ହୋଇ ଚିଲାଣ୍ଟ ଗଠନରେ NT ଏକ ପ୍ରମୁଖ ଭୂମିକା ଗ୍ରହଣ କରିଥାଏ |16, 18, 19, 20, 26, 27, 28, 29 ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ ଅଧ୍ୟୟନ କରାଯାଇଥିବା ସମସ୍ତ ଅବସ୍ଥାରେ NT ଅତ୍ୟଧିକ ଦ୍ରବୀଭୂତ ଏବଂ ହେଲିକଲ୍ ରହିଥାଏ, ଯାହା ହେଟେରୋଲୋଜିସ୍ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଉତ୍ପାଦନ ପାଇଁ ଏକ ଦ୍ରବଣ-ବର୍ଦ୍ଧିତ ଲେବଲ୍ ଭାବରେ ଏହାର ବିକାଶକୁ ପ୍ରେରଣା ଦେଇଥିଲା |
ବିଶୋଧନ ପାଇଁ ରେକମ୍ବିନାଣ୍ଟ ମିନି ସ୍ପାଇଡର୍ ରେଶମ ପ୍ରୋଟିନ୍, ଗୋଟିଏ NT, ଗୋଟିଏ କ୍ଷୁଦ୍ର ପୁନରାବୃତ୍ତି ଅଞ୍ଚଳ, ଗୋଟିଏ CT, ଏବଂ His6 ଟ୍ୟାଗ୍ (His-NT2RepCT) କୁ ନେଇ ଗଠିତ, ଜଳୀୟ ବଫର୍ରେ ଦେଶୀ ସ୍ପାଇଡର୍ ରେଶମ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଏବଂ ରେଶମ ସ୍ପାଇଡରର ଦେଶୀ ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ବ characteristics ଶିଷ୍ଟ୍ୟକୁ ଅନୁକରଣ କରେ | ।କଭରେଜ୍ 25.31ତାଙ୍କର- NT2RepCT ଏକ ବାୟୋମାଇମେଟିକ୍ ମେସିନ୍ ବ୍ୟବହାର କରି କ୍ରମାଗତ ଫାଇବରରେ ସ୍ପନ୍ ହୋଇପାରେ ଯେଉଁଥିରେ ଏକ pH 8 ଦ୍ରବଣୀୟ ଆବରଣ ଏକ pH 525,32,33,34,35 ଜଳ ସ୍ନାନରେ ବାହାର କରାଯାଇଥାଏ |ଇ-କୋଲିର ବାୟୋରେକ୍ଟର ଫେମେଣ୍ଟେସନ୍ His-NT2RepCT ଏବଂ ପରବର୍ତ୍ତୀ ଚିକିତ୍ସା ଦ୍ pur ାରା ଶୁଦ୍ଧ ହେବା ପରେ> 14 g / L ଅମଳ ହୋଇଥିଲା |ଉଚ୍ଚ ଅମଳ, ଉଚ୍ଚ ଦ୍ରବଣୀୟତା ଏବଂ ଅମ୍ଳୀୟ ଅବସ୍ଥାରେ His-NT2RepCT ର ପର୍ଯ୍ୟାପ୍ତ ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ସମସ୍ତଙ୍କୁ NT23, 25, 34 କୁ ଦାୟୀ କରାଯାଇଛି |
ଏଠାରେ ଆମେ 37 ° C ରେ ଏକ ପ୍ରୋଟିନ୍ ସଲ୍ୟୁସନ୍ ଇନ୍କ୍ୟୁବ୍ କରି ରେକମ୍ବିନାଣ୍ଟ ସ୍ପିଡ୍ରୋଏନ୍ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଠାରୁ ସ୍ୱଚ୍ଛ ହାଇଡ୍ରୋଜେଲଗୁଡିକର ଦ୍ରୁତ ଗଠନ ବିଷୟରେ ରିପୋର୍ଟ କରୁ |ଥିଓଫ୍ଲାଭିନ୍ ଟି ଫ୍ଲୋରୋସେନ୍ସ (ThT), ଫୁରିଅର୍ ଟ୍ରାନ୍ସଫର୍ମ ଇନଫ୍ରାଡ୍ ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରସ୍କୋପି (FTIR), ଆଣବିକ ଚୁମ୍ବକୀୟ ରିଜୋନାନ୍ସ ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରସ୍କୋପି (NMR) ଏବଂ ଟ୍ରାନ୍ସମିସନ୍ ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋନ ମାଇକ୍ରୋସ୍କୋପି (TEM) ବ୍ୟବହାର କରି ଆମେ ଜାଣିଲୁ ଯେ NT ଏବଂ ମାଇକ୍ରୋସ୍ପାଇଡର୍ ପ୍ରୋଟିନ୍ β- ଶୀଟ୍ ଏବଂ ଆମିଲଏଡ୍ ପରି ଫାଇବ୍ରିଲରେ ଗଠନମୂଳକ ରୂପାନ୍ତର କରୁଛନ୍ତି | ଯେତେବେଳେ ଜେଲ୍ ଗଠନ ହୁଏ |ଏହା ସହିତ, NT ର ଫ୍ୟୁଜନ୍ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଏବଂ ସବୁଜ ଫ୍ଲୋରୋସେଣ୍ଟ୍ ପ୍ରୋଟିନ୍ (GFP) କିମ୍ବା ପ୍ୟୁରିନ୍ ନ୍ୟୁକ୍ଲିଓସାଇଡ୍ ଫସଫୋରୀଲେଜ୍ (PNP) ସଂପୂର୍ଣ୍ଣ କାର୍ଯ୍ୟକ୍ଷମ ଫ୍ୟୁଜନ୍ ଖଣ୍ଡ ସହିତ ହାଇଡ୍ରୋଜେଲ ସୃଷ୍ଟି କରେ |ହେଟେରୋଲୋଜିକ୍ ହୋଷ୍ଟଗୁଡିକରେ ଉଚ୍ଚ-ଥ୍ରୋପଟ୍ ଅଭିବ୍ୟକ୍ତି, ଶାରୀରିକ ପରିସ୍ଥିତିରେ ହାଇଡ୍ରୋଜେଲଗୁଡିକର ଶୀଘ୍ର ଗଠନ ସହିତ, ଇଞ୍ଜିନିୟରିଂ କାର୍ଯ୍ୟଗୁଡ଼ିକ ସହିତ ହାଇଡ୍ରୋଜେଲଗୁଡିକର ବ୍ୟୟବହୁଳ ଉତ୍ପାଦନ ସମ୍ଭାବନାକୁ ଖୋଲିଥାଏ |
ଅଧିକାଂଶ ରିପୋର୍ଟ ହୋଇଥିବା ରେକମ୍ବିନାଣ୍ଟ ସ୍ପିଡ୍ରୋଏନ୍ ପ୍ରୋଟିନ୍ ତୁଳନାରେ, His-NT2RepCT ଟ୍ରାଇସ୍- HCl ବଫର୍ ରେ pH 8 ରେ ସ୍ଥିର ଅଟେ ଏବଂ ବର୍ଷା ବିନା 500 ମିଗ୍ରା / ମିଏଲ୍ ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ ଏକାଗ୍ର ହୋଇପାରେ |ତେଣୁ, ଆମେ ଜାଣି ଆଶ୍ଚର୍ଯ୍ୟ ହୋଇଗଲୁ ଯେ 37 ° C (ଚିତ୍ର 1b-d) ରେ ଇନ୍କ୍ୟୁବେଡ୍ ହେବାବେଳେ ଏହି ପ୍ରୋଟିନ୍ ଶୀଘ୍ର ଅପ୍ଟିକାଲ୍ ସ୍ୱଚ୍ଛ, ସ୍ supporting ୟଂ ସହାୟକ ହାଇଡ୍ରୋଜେଲ ଗଠନ କରେ |ପରବର୍ତ୍ତୀ ଅଧ୍ୟୟନରୁ ଜଣାପଡିଛି ଯେ ତାଙ୍କର- NT2RepCT ଜେଲେସନ୍ ବିଭିନ୍ନ ପ୍ରକାରର ପ୍ରୋଟିନ୍ ଏକାଗ୍ରତା (10–300 ମିଗ୍ରା / ମିଏଲ୍) ଉପରେ ଘଟିଛି ଏବଂ ଏହି ଏକାଗ୍ରତା ଜେଲେସନ୍ ସମୟ ସହିତ ବିପରୀତ ଭାବରେ ସମ୍ପର୍କିତ ହୋଇଛି (ଚିତ୍ର 1c ଏବଂ ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 1) |His-NT2RepCT ମଧ୍ୟସ୍ଥ ହାଇଡ୍ରୋଜେଲ ଗଠନର କେଉଁ ଅଂଶ ଜାଣିବା ପାଇଁ, ତା’ପରେ ଆମେ ପ୍ରତ୍ୟେକ ଡୋମେନ୍ କୁ ପୃଥକ ଭାବରେ ଏବଂ ଫ୍ଲାସ୍କ ଇନଭର୍ସନ୍ ଆସେ ବ୍ୟବହାର କରି ବିଭିନ୍ନ ମିଶ୍ରଣରେ ପରୀକ୍ଷା କରିଥିଲୁ (ଚିତ୍ର 1a, b) |ରେକମ୍ବିନାଣ୍ଟ ସ୍ପାଇଡ୍ରଏନ୍ର ସମସ୍ତ ପରୀକ୍ଷିତ ଭଗ୍ନାଂଶଗୁଡିକ 1 ଘଣ୍ଟାରୁ କମ୍ ସମୟ ମଧ୍ୟରେ ଜେଲ୍ ଗଠନ କରିଥିଲେ (300 ମିଗ୍ରା / ମି.ଏଲ୍ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଏକାଗ୍ରତାରେ), 2Rep (ଚିତ୍ର 1 ବି) ବ୍ୟତୀତ |ଏହା ସୂଚିତ କରେ ଯେ NT ଏବଂ CT ଏକାକୀ, କିମ୍ବା ପୁନରାବୃତ୍ତି ସହିତ ଜଡିତ, 37 ° C ରେ ଜେଲ୍ ହୋଇପାରେ ଏବଂ His6 ଟ୍ୟାଗ୍ ଏହି ପ୍ରକ୍ରିୟାକୁ କ significant ଣସି ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ପ୍ରଭାବ ପକାଇବ ନାହିଁ |ସାଧାରଣ ଧାରଣାକୁ ଦିଆଯାଉଛି ଯେ NT ଏକ ଅତ୍ୟଧିକ ଦ୍ରବୀଭୂତ ଏବଂ ସ୍ଥିର ପ୍ରୋଟିନ୍ ଅଟେ, ଏବଂ ରେକମ୍ବିନାଣ୍ଟ ସ୍ପିଡ୍ରଏନ୍ ହାଇଡ୍ରୋଜେଲଗୁଡିକର ପୂର୍ବ ରିପୋର୍ଟଗୁଡିକ ପୁନରାବୃତ୍ତି ଅଞ୍ଚଳ ଏବଂ / କିମ୍ବା CT ଗୁଡ଼ିକର ପରିବର୍ତ୍ତନଶୀଳ ପରିବର୍ତ୍ତନ ସହିତ ଜେଲେସନ୍ ପ୍ରଭାବକୁ ଦର୍ଶାଇଥାଏ, NT ନିଜେ କରିପାରେ |ଜେଲେସନ୍ ଆବିଷ୍କାର ଅପ୍ରତ୍ୟାଶିତ ଥିଲା |ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଟେବୁଲ୍ 1) 37, 38, 39. ଉଲ୍ଲେଖନୀୟ, NT ପୂର୍ବରୁ mg 300 mg / mL (ଚିତ୍ର 1c) ର ଏକାଗ୍ରତାରେ 10 ମିନିଟ୍ ମଧ୍ୟରେ ଜେଲ୍ ହୋଇସାରିଛି |NT ର ବିଭିନ୍ନ ଏକାଗ୍ରତା ସହିତ ଭିଆଲ୍ ବିପରୀତ ପରୀକ୍ଷଣଗୁଡିକ ଦର୍ଶାଇଲା ଯେ> 50 ମିଗ୍ରା / ମି.ଏଲ୍ ରେ NT ସମାଧାନ ସଂପୃକ୍ତ ଏକାଗ୍ରତାରେ His-NT2RepCT ଅପେକ୍ଷା ଶୀଘ୍ର ଗେଲ ହୋଇଛି |
ଏହି କାର୍ଯ୍ୟରେ ଅଧ୍ୟୟନ କରାଯାଇଥିବା ବିଭିନ୍ନ ସ୍ପିଡ୍ରୋଏନ୍ ନିର୍ମାଣଗୁଡ଼ିକର ସ୍କିମେଟିକ୍ ଉପସ୍ଥାପନା |b ବିଭିନ୍ନ ରେକମ୍ବିନାଣ୍ଟ ସ୍ପିଡ୍ରୋଏନ୍ ପ୍ରୋଟିନ୍ (300 ମିଗ୍ରା / ମି.ଏଲ୍) ପାଇଁ ଜେଲ୍ ସମୟ 37 ° C ରେ ଭିଆଲ୍ ଓଲଟାଇ ଯାଞ୍ଚ କରାଯାଇଥାଏ |ଇନକ୍ୟୁବେସନ ବିନା ସି.ଟି.c His-NT2RepCT ଏବଂ NT ର ଜେଲ୍ ସମୟ 37 ° C ରେ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଏକାଗ୍ରତା |d ସ୍ପାଇଡର୍ ସହିତ His-NT2RepCT ଏବଂ NT ହାଇଡ୍ରୋଜେଲ୍ର ଫଟୋଗ୍ରାଫ୍ ଏବଂ ତଳେ ଛାପାଯାଇଥିବା “NT” ଅକ୍ଷର ଯଥାକ୍ରମେ (ଉଭୟ 200 ମିଗ୍ରା / ମି.ଏଲ୍, ସ୍କେଲ୍ ବାର୍ 5 ମିମି) |
ବିଭିନ୍ନ ରେକମ୍ବିନାଣ୍ଟ ସ୍ପିଡ୍ରୋଏନ୍ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଦ୍ formed ାରା ଗଠିତ ହାଇଡ୍ରୋଜେଲଗୁଡିକର ସାମାନ୍ୟ ଭିନ୍ନ ରଙ୍ଗ ଥାଏ, ଏବଂ ଉଲଗ୍ନ ଆଖି ପର୍ଯ୍ୟବେକ୍ଷଣରେ ବିଭିନ୍ନ ପ୍ରକାରର ସ୍ୱଚ୍ଛତା ଦେଖାଯାଏ (ଚିତ୍ର 1 ବି) |ଅନ୍ୟ ଜେଲଗୁଡିକ ଅସ୍ପଷ୍ଟ ଥିବାବେଳେ NT ଜେଲଗୁଡିକ ସ୍ ally ତନ୍ତ୍ର ଭାବରେ ସ୍ୱଚ୍ଛ ଅଟେ |ସିଲିଣ୍ଡ୍ରିକ୍ ଟ୍ୟୁବରେ ପକାଯାଇଥିବା ତାଙ୍କର- NT2RepCT ଏବଂ NT ଜେଲଗୁଡିକ ଛାଞ୍ଚ ଅକ୍ଷୁର୍ଣ୍ଣରୁ ବାହାର କରାଯାଇପାରିବ (ଚିତ୍ର 1d) |
ପ୍ରାକୃତିକ ସ୍ପାଇଡର ରେଶମ ଆବରଣ ଜେଲ ବର୍ତ୍ତମାନ ରେକମ୍ବିନାଣ୍ଟ ସ୍ପାଇଡ୍ରଏନ ପ୍ରୋଟିନର ଜେଲେସନ ସୃଷ୍ଟି କରୁଥିବା ଦେଖିବାକୁ ମିଳୁଛି କି ନାହିଁ ପରୀକ୍ଷା କରିବା ପାଇଁ, ସ୍ୱିଡେନ ବ୍ରିଜ ସ୍ପାଇଡର (ଲାରିନିଓଏଡସ୍ ସ୍କ୍ଲୋପେଟାରିଅସ) ର ବଡ଼ ଆମ୍ପୁଲା ଗ୍ରନ୍ଥିରୁ ଆବରଣ ସଂଗ୍ରହ କରାଯାଇଥିଲା |ଆବରଣଗୁଡିକ 20 ମିମି ଟ୍ରାଇସ୍- HCl ବଫର୍ରେ 50 ମିଗ୍ରା / ମି.ଏଲ୍ (ମାପାଯାଇଥିବା ଶୁଖିଲା ଓଜନ ଉପରେ ଆଧାର କରି) ଗଚ୍ଛିତ ହୋଇଥିଲା, କିନ୍ତୁ 37 ° C ରେ 21 ଦିନ ଇନକ୍ୟୁବେସନ ସମୟରେ କ ge ଣସି ଜେଲେସନ୍ ପରିଲକ୍ଷିତ ହୋଇନଥିଲା (ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 2a) |
ଏହି ଜେଲଗୁଡିକର ପରିମାଣ କରିବାକୁ, ରିଓୋଲୋଜିକାଲ୍ ମାପଗୁଡିକ ଜେଲେସନ୍ ପ୍ରକ୍ରିୟା ଅଧ୍ୟୟନ କରିବା ଏବଂ ସାମଗ୍ରିକ ଯାନ୍ତ୍ରିକ ଗୁଣ ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରିବା ପାଇଁ ବ୍ୟବହୃତ ହୋଇପାରେ |ବିଶେଷ ଭାବରେ, ଉତ୍ତାପ ତାପମାତ୍ରାରେ ଷ୍ଟୋରେଜ୍ ମଡ୍ୟୁଲସ୍ (ଇଲାସ୍ଟିସିଟି) ଉପରେ ନଜର ରଖିବା ଦ୍ୱାରା ଗେଲିଂ ତାପମାତ୍ରା ଏବଂ ଆବରଣର ଭିସକୋଲେଷ୍ଟିକ୍ ଗୁଣ ବିଷୟରେ ସୂଚନା ପ୍ରଦାନ କରାଯାଇପାରେ |ତାପମାତ୍ରା ବୃଦ୍ଧି ପରୀକ୍ଷଣ (ପ୍ରାକୃତିକ ରେଶମ ଷ୍ଟକ୍ ସମାଧାନ ବ୍ୟବହାର କରି ପୂର୍ବ ଅଧ୍ୟୟନ ଉପରେ ଆଧାର କରି 25-45 ° C ରେ 1 ° C / ମିନିଟ୍ ବ୍ୟବହାର କରି) 40,41 ଦର୍ଶାଇଲା ଯେ His-NT2RepCT ଏବଂ NT ସମାଧାନର ଷ୍ଟୋରେଜ୍ ମଡ୍ୟୁଲି ତାପମାତ୍ରା ବୃଦ୍ଧି ସହିତ ବୃଦ୍ଧି ପାଇଲା |ବୃଦ୍ଧି କରାଯାଇଥିଲା (ଚିତ୍ର 2 ଏବଂ ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 3) |ଉଲ୍ଲେଖଯୋଗ୍ୟ, His-NT2RepCT ତୁଳନାରେ NT ମଡ୍ୟୁଲ୍ କମ୍ ତାପମାତ୍ରାରେ ବ growing ିବାକୁ ଲାଗିଲା, ଦ୍ରୁତ ଜେଲ୍ ସମୟ ସହିତ ଅନୁରୂପ ଥିଲା ଯେତେବେଳେ NT 37-C ରେ His-NT2RepCT ସହିତ ସିଧାସଳଖ ଭାବରେ ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତ ହୋଇଥିଲା (ଚିତ୍ର 1) |ତାପମାତ୍ରାର ପରବର୍ତ୍ତୀ ହ୍ରାସ ପରେ, ଷ୍ଟୋରେଜ୍ ମଡ୍ୟୁଲସ୍ କମ୍ ମୂଲ୍ୟକୁ ଫେରି ନଥିଲା ଏବଂ କ୍ଷତି ମଡ୍ୟୁଲସ୍ ଉପରେ ରହିଲା (ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 3 ଦେଖନ୍ତୁ), ଯାହା ଥର୍ମାଲି ଅଦୃଶ୍ୟ ସ୍ଥିର ଜେଲେସନ୍ ସୂଚାଇଥାଏ |ଜେଲେସନ୍ ପରେ, ଚୂଡାନ୍ତ ଇଲେଷ୍ଟିକ୍ ମଡ୍ୟୁଲସ୍ His-NT2RepCT ହାଇଡ୍ରୋଜେଲ ପାଇଁ 100 ରୁ 500 ମିଗ୍ରା / ମିଏଲ୍ର ଏକାଗ୍ରତାରେ 15 ରୁ 330 kPa ମଧ୍ୟରେ ରହିଥିଲା ଏବଂ NT ହାଇଡ୍ରୋଜେଲ (100-500 ମିଗ୍ରା / ଏମଏଲ୍) ପାଇଁ ଅନ୍ତିମ ଇଲାଷ୍ଟିକ୍ ମଡ୍ୟୁଲସ୍ 2 ରୁ 1400 ମଧ୍ୟରେ ରହିଥିଲା | kPa (ଚିତ୍ର, 2 ଏବଂ ସଂପୂର୍ଣ୍ଣ ରାମ୍ପ ତଥ୍ୟ) ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 3 ଦେଖନ୍ତୁ) |
His-NT2RepCT (300 mg / mL) ଏବଂ b NT (300 mg / mL) ମାପିବା ସମୟରେ ତାପମାତ୍ରାରେ ପରିବର୍ତ୍ତନ |ତୀରଗୁଡ଼ିକ ତାପମାତ୍ରା ଧାରାକୁ ସୂଚାଇଥାଏ, ଏବଂ ଷ୍ଟୋରେଜ୍ ମଡ୍ୟୁଲ୍ ତଥ୍ୟର ହାଲୁକା ଛାୟା ନିର୍ମାତା ଦ୍ୱାରା ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ହେବା ଅପେକ୍ଷା ଯନ୍ତ୍ର ପାଇଁ କମ୍ ଟର୍କ ମୂଲ୍ୟରେ ପରୀକ୍ଷଣକୁ ଚିତ୍ରଣ କରିଥାଏ, ଯାହା ଶବ୍ଦର ବୃଦ୍ଧି ହେବାର କାରଣ ଅଟେ |c ଉତ୍ତାପ ତାପମାତ୍ରା (100, 300, ଏବଂ 500 mg / mL) ପରେ His-NT2RepCT ଏବଂ NT ର ଶେଷ-ମଡ୍ୟୁଲ୍ ଜମା |ସମସ୍ତ ମଡ୍ୟୁଲ୍ ପଠନ 0.1 Hz ଫ୍ରିକ୍ୱେନ୍ସିରେ ନିଆଯାଏ |
ଜେଲେସନ୍ ସହିତ ଜଡିତ ଗଠନମୂଳକ ପରିବର୍ତ୍ତନଗୁଡ଼ିକର ଅନୁସନ୍ଧାନ ପାଇଁ ଏକ ସମ୍ଭାବ୍ୟ ପଦ୍ଧତି ଭାବରେ, ଆମେ 37 ° C ରେ ଜେଲେସନ୍ ପୂର୍ବରୁ ଏବଂ ପରେ His-NT2RepCT ଏବଂ NT ର FTIR ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରା ରେକର୍ଡ କରିଥିଲୁ (ଚିତ୍ର 3a, b) |ଆଶା କରାଯାଉଥିବା ପରି, His-NT2RepCT ଏବଂ NT ସମାଧାନର ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରା α- ହେଲିକ୍ସ / ରାଣ୍ଡମ୍ କୋଇଲ୍ ଦ୍ secondary ିତୀୟ ଗଠନ ଦେଖାଉଥିବା ପ୍ରୋଟିନ୍ ସହିତ ଅନୁରୂପ ଥିଲା, 1645 ସେମି -1 ରେ ଏକ ଉଚ୍ଚାରଣ ବ୍ୟାଣ୍ଡ ସହିତ |ଉଭୟ ହାଇଡ୍ରୋଜେଲ ପାଇଁ, ଜେଲେସନ୍ ଦ୍ I ାରା ପ୍ରାୟ 1617 ସେମି -1 ଏବଂ 1695 ସେମି -1 (ଚିତ୍ର 3a, b) ରେ ମଧ୍ୟମ I ବ୍ୟାଣ୍ଡରେ ଦୁଇଟି ବାହୁ ସୃଷ୍ଟି ହୋଇଥିଲା, ଯାହା ଆଣ୍ଟିପାରାଲାଲ୍ β- ସିଟ୍ ଗଠନକୁ ସୂଚାଇଥାଏ |ଏହି ପରିବର୍ତ୍ତନଗୁଡିକ ସଂପୃକ୍ତ ଦ୍ୱିତୀୟ ଡେରିଭେଟିଭ୍ ଏବଂ ପାର୍ଥକ୍ୟ ଜେଲେସନ୍ ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରା (ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 4b) ରେ ମଧ୍ୟ ସ୍ପଷ୍ଟ ଭାବରେ ଦେଖାଯାଏ |NT β- ସ୍ତରର ଦୁଇଟି ବ୍ୟାଣ୍ଡ His-NT2RepCT ତୁଳନାରେ ଅଧିକ ସ୍ପଷ୍ଟ ହୋଇଥିଲା, ସୂଚାଇଥାଏ ଯେ NT ହାଇଡ୍ରୋଜେଲରେ β- ସ୍ତର ବ୍ୟାଣ୍ଡର ମୋଟ ବିଷୟବସ୍ତୁ NT2RepCT ହାଇଡ୍ରୋଜେଲ ତୁଳନାରେ ଅଧିକ ଥିଲା |
His-NT2RepCT ଏବଂ b NT (ଉଭୟ 500 ମିଗ୍ରା / ଏମଏଲ୍) ର FTIR ଅବଶୋଷଣ ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରା (ସମାଧାନ) ପୂର୍ବରୁ ଏବଂ 37 ° C ରେ (ଜେଲ୍) ଇନକ୍ୟୁବେସନ ପରେ |c 50 mg / ml NT2RepCT ଜେଲ ଏବଂ d NT ର TEM ପ୍ରତିଛବିଗୁଡ଼ିକ |ସ୍କେଲ ବାର୍ 200 nmଇ- NT2RepCT ଏବଂ NT ହାଇଡ୍ରୋଜେଲଗୁଡିକର ଫାଇବର ବ୍ୟାସ |n = 100 ମାପାଯାଇଥିବା ଫାଇବ୍ରିଲ୍, p <0.0001 |ତ୍ରୁଟି ଦଣ୍ଡିକା ମାନକ ବିଘ୍ନକୁ ଦର୍ଶାଏ |ତ୍ରୁଟି ଦଣ୍ଡଗୁଡ଼ିକର କେନ୍ଦ୍ର ହେଉଛି ଅର୍ଥ |ପରିସଂଖ୍ୟାନ ବିଶ୍ଳେଷଣ ପାଇଁ ଏକ ଅବିଭକ୍ତ ଟି-ଟେଷ୍ଟ (ଦୁଇ-ଲାଞ୍ଜ) ବ୍ୟବହୃତ ହେଲା |f କମ୍ପନ ନକରି ବିଭିନ୍ନ ରେକମ୍ବିନାଣ୍ଟ ସ୍ପିଡ୍ରୋଏନ୍ ପ୍ରୋଟିନ୍ (100 ମିଗ୍ରା / ମି.ଏଲ୍) ର ThT ଫ୍ଲୋରୋସେନ୍ସ |g NT (100 mg / mL) 100% mg / mL NT ଜେଲରୁ 0%, 5%, 10%, ଏବଂ 20% ମଞ୍ଜି ସହିତ ଇନୋକ୍ୟୁଲେସନ ପରୀକ୍ଷଣ |
ଟ୍ରାନ୍ସମିସନ ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋନ ମାଇକ୍ରୋସ୍କୋପି (TEM) ବ୍ୟବହାର କରି ଜେଲର ବିଶ୍ଳେଷଣରୁ ଜଣାପଡିଛି ଯେ ହାଇଡ୍ରୋଜେଲରେ ଆମିଲଏଡ ପରି ଫାଇବ୍ରିଲ ଥାଏ (ଚିତ୍ର 3c, 3d) |NT- ଗଠିତ ଫାଇବ୍ରିଲଗୁଡିକ (5–12 nm ବ୍ୟାସ) ଏବଂ ଅଣ-ଶାଖା ହୋଇଥିବାବେଳେ His-NT2RepCT ଫାଇବ୍ରିଲଗୁଡ଼ିକର ଲମ୍ବ ଛୋଟ ଏବଂ ବ୍ୟାସ (7-16 nm) (ଚିତ୍ର 3e) |ଏହି ଫଳାଫଳଗୁଡିକ ଆମକୁ ଥିଓଫ୍ଲାଭିନ୍ ଟି (ThT) ଆସେ ବ୍ୟବହାର କରି ଫାଇବ୍ରୋସିସ୍ ର ଗତିଜ ଅନୁସରଣ କରିବାକୁ ଅନୁମତି ଦେଲା |ସମସ୍ତ ରେକମ୍ବିନାଣ୍ଟ ସ୍ପିଡ୍ରୋଏନ୍ ପ୍ରୋଟିନ୍ ପାଇଁ, 37 ° C ରେ ନମୁନା ଇନ୍କ୍ୟୁବେଡ୍ ହେବାପରେ ଫ୍ଲୋରୋସେଣ୍ଟ୍ ସିଗ୍ନାଲ୍ ବୃଦ୍ଧି ପାଇଲା (ଚିତ୍ର 3f, ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 5a) |ଏହି ଅନୁସନ୍ଧାନ ସହିତ ସ୍ଥିର, ଗେଲିଂ ଅବସ୍ଥାରେ NT ଏବଂ His-NT2RepCT ର ମାଇକ୍ରୋସ୍କୋପିକ୍ ପରୀକ୍ଷଣ, ThT- ପଜିଟିଭ୍ ଏଗ୍ରିଗେଟ୍ଗୁଡ଼ିକର ସ୍ଥାନୀୟ ଜମା ବିନା ThT ଫ୍ଲୋରୋସେନ୍ସରେ ସମାନ ବୃଦ୍ଧି ଘଟାଇଲା (ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 5b, c) |ThT- ପଜିଟିଭ୍ ଫାଇବ୍ରିଲ୍ ଗଠନ NT ଏବଂ His-NTCT ଟର୍ବିଡିଟି (ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଡ଼ିମ୍। 5d) ର ବୃଦ୍ଧି ସହିତ ଆସି ନଥିଲା, ଯାହାର ଅର୍ଥ ହେଉଛି ଜେଲରେ ଥିବା ଫାଇବ୍ରିଲ୍ସର ଏକ ନେଟୱାର୍କ ଜେଲ୍ ସ୍ୱଚ୍ଛତାକୁ ସାମ୍ନା ନକରି ସୃଷ୍ଟି ହୋଇପାରେ |ଅଳ୍ପ ପରିମାଣର ପୂର୍ବ-ଗଠିତ ଫାଇବ୍ରିଲ୍ ଯୋଗ କରି ବିହନ ଦ୍ am ାରା କିଛି ଆମିଲଏଡ୍ର ଫାଇବ୍ରିଲ୍ ଗଠନ ଯଥେଷ୍ଟ ତ୍ୱରାନ୍ୱିତ ହୋଇପାରେ 42,43,44 କିନ୍ତୁ NT ହାଇଡ୍ରୋକାଗୁଲାଣ୍ଟର ସମାଧାନରେ 5%, 10% କିମ୍ବା 20% (w / w) NT ଯୋଗ କରିଥାଏ |ବିହନ ପ୍ରଭାବ (ଚିତ୍ର 3g) |ବୋଧହୁଏ ଏହା ହେତୁ ହେଡ୍ରୋଜେଲରେ ଥିବା ଫାଇବ୍ରିଲଗୁଡିକ ଅପେକ୍ଷାକୃତ ସ୍ଥିର ହୋଇଛି ଏବଂ ମଞ୍ଜି ଭାବରେ ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇପାରିବ ନାହିଁ |
ଉଚ୍ଚ ତାପମାତ୍ରାରେ ରେକମ୍ବିନାଣ୍ଟ ସ୍ପିଡ୍ରୋଏନ୍ ପ୍ରୋଟିନଗୁଡିକର ଅପ୍ରତ୍ୟାଶିତ ଆଚରଣ ପରମାଣୁ ଚୁମ୍ବକୀୟ ରିଜୋନାନ୍ସ (NMR) ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରସ୍କୋପି ଅଧ୍ୟୟନକୁ ଜେଲ୍ ଗଠନ ସହିତ ଜଡିତ ଗଠନମୂଳକ ପରିବର୍ତ୍ତନଗୁଡ଼ିକୁ ଚିହ୍ନଟ କରିବାକୁ ପ୍ରେରିତ କଲା |37 ° C ରେ ରେକର୍ଡ ହୋଇଥିବା His-NT2RepCT ସମାଧାନର NMR ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରା ଦର୍ଶାଇଲା ଯେ CT ତଥାପି ଆଂଶିକ ଫୋଲ୍ଡ୍ ହୋଇଛି, ଯେତେବେଳେ କି NT ଏବଂ 2Rep ସଙ୍କେତ ଅଦୃଶ୍ୟ ହୋଇଯାଇଛି (ଚିତ୍ର 4a), ଏହା ସୂଚିତ କରେ ଯେ ଏହା ମୁଖ୍ୟତ NT NT ଏବଂ 2Rep ଅଟେ ଯାହା His- ର ଗଠନକୁ ଆଂଶିକ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ କରିଥିଲା | NT2RepCT ହାଇଡ୍ରୋଜେଲ୍ |CT ସଙ୍କେତ ମଧ୍ୟ ଏହାର ମୂଳ ତୀବ୍ରତାର 20% ସହିତ ସଂଲଗ୍ନ କରାଯାଇଥିଲା, ଏହା ସୂଚିତ କରେ ଯେ CT ମଧ୍ୟ ସ୍ଥିର ଏବଂ ହାଇଡ୍ରୋଜେଲ ସଂରଚନାରେ ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତ |CT ର ଏକ ଛୋଟ ଅଂଶ ପାଇଁ, ଯାହା ପ୍ରିନ୍କ୍ୟୁବେଡ୍ ନମୁନା ପରି ମୋବାଇଲ୍ ଅଟେ ଏବଂ ଏହିପରି NMR ସମାଧାନ ଦ୍ observed ାରା ପରିଲକ୍ଷିତ ହୁଏ, ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରାର ପ୍ରଥମ ୧୦ଟି ସଂରକ୍ଷିତ ଅବଶିଷ୍ଟାଂଶ ପାଇଁ ସଙ୍କେତ ଅଭାବ, ସମ୍ଭବତ His His-NT2Rep ର ସଂଲଗ୍ନ ଅଂଶର କଷ୍ଟସାଧ୍ୟ ଅସ୍ଥିରତା ହେତୁ |ହାଇଡ୍ରୋଜେଲ -NT2RepCT ର NMR ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରା α- ହେଲିକ୍ସ ଏବଂ β- ସ୍ତରର ମୁଖ୍ୟ ଉପସ୍ଥିତି ଏବଂ କମ୍ ପରିମାଣରେ, ଅନିୟମିତ କୋଇଲ୍ ରୂପାନ୍ତର (ଚିତ୍ର 4b) ପ୍ରକାଶ କଲା |କେବଳ NT ରେ ଉପସ୍ଥିତ ଥିବା ମିଥୋନିନ୍ ଅବଶିଷ୍ଟଗୁଡିକର ରାସାୟନିକ ଶିଫ୍ଟ ବିଶ୍ଳେଷଣ ଦର୍ଶାଇଲା ଯେ ଏହି ଡୋମେନ୍ β- ସିଟ୍ ସଂରଚନାରେ ରୂପାନ୍ତରିତ ହୋଇଛି |ସମାଧାନରେ NT ର ସମୟ ନିର୍ଭରଶୀଳ ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରା ସିଗନାଲ୍ ତୀବ୍ରତାର ସମାନ ହ୍ରାସ ଦେଖାଇଲା (ଚିତ୍ର 4c), ଏବଂ NT ହାଇଡ୍ରୋଜେଲଗୁଡିକର କଠିନ ସ୍ଥିତ NMR ଦର୍ଶାଇଲା ଯେ ଅଧିକାଂଶ NT ଅବଶିଷ୍ଟାଂଶ β- ସିଟ୍ ସଂରଚନାରେ ରୂପାନ୍ତରିତ ହୋଇଛି (ଚିତ୍ର 4d) |ଏକତ୍ର ହେବାର ପ୍ରବୃତ୍ତି ହେତୁ 2Rep ର ରୂପାନ୍ତର ପୃଥକ ଭାବରେ ନିର୍ଣ୍ଣୟ ହୋଇପାରିଲା ନାହିଁ |ଅବଶ୍ୟ, NTCT ଏବଂ His-NT2RepCT ହାଇଡ୍ରୋଜେଲଗୁଡିକର ଦୃ solid ସ୍ଥିତି NMR ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରା ବହୁତ ସମାନ ଦେଖାଯାଉଥିଲା (ଚିତ୍ର 4b; ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 6b), ଏହା ଦର୍ଶାଏ ଯେ His-NT2RepCT ହାଇଡ୍ରୋଜେଲର ଗଠନମୂଳକ ଅଂଶରେ 2Rep ଅଳ୍ପ ଅବଦାନ ଦେଇଛି |ସିଟି ହାଇଡ୍ରୋଜେଲ ପାଇଁ, α- ହେଲିକ୍ସ, β- ସିଟ୍, ଏବଂ ରାଣ୍ଡମ ହେଲିକାଲ୍ ସେକେଣ୍ଡାରୀ ଷ୍ଟ୍ରକଚରଗୁଡିକ ବିଦ୍ୟମାନ ଥିବା ଦେଖିବାକୁ ମିଳିଥିଲା (ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 6d) |ଏହା ସୂଚିତ କରେ ଯେ CT ର କିଛି ଅଂଶ α- ହେଲିକ୍ସ ରହିଥାଏ ଏବଂ ଅନ୍ୟଗୁଡିକ β- ଶୀଟ୍ ହୋଇଯାଏ |ଏହିପରି, NMR ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରସ୍କୋପିର ଫଳାଫଳ ସୂଚିତ କରେ ଯେ ହାଇଡ୍ରୋଜେଲ ଗଠନ ପାଇଁ NT ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ଅଟେ ଏବଂ 2Rep ଏବଂ CT ସହିତ ମିଶ୍ରଣ ପରେ ଏକ β- ଶୀଟ୍ ରୂପାନ୍ତରଣରେ ପରିଣତ ହୁଏ |ଏହା ସହିତ ସ୍ଥିର ହୋଇ, ଆମେ ନିକଟରେ ପାଇଲୁ ଯେ ଆମିଲଏଡ୍ ସ୍ପେସାଲ୍ ଜିପର୍ ଗୁଡିକ NT ଡୋମେନ୍ ର ସମସ୍ତ ପାଞ୍ଚଟି ହେଲିକରେ ସୃଷ୍ଟି ହୋଇପାରେ ଏବଂ ୱାଲ୍ଟଜ୍ ଆଲଗୋରିଦମ ହେଲିକ୍ସ 1 (ଚିତ୍ର 4e) ରେ ଏକ ଆମିଲଏଡୋଜେନିକ୍ ଅଞ୍ଚଳର ଭବିଷ୍ୟବାଣୀ କରିଥିଲେ |
15N-HSQC 10 mg / mL His-NT2RepCT ସମାଧାନର 2D ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରା (ନୀଳ) ଏବଂ ଇନକ୍ୟୁବେସନ (ଲାଲ) ର 19 ଘଣ୍ଟା ପରେ 37 ° C ରେ |ଲାଲ୍ ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରମରେ ବ୍ୟକ୍ତିଗତ କ୍ରସ୍ ଶିଖର ଏବଂ ନୀଳ ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରମରେ F24, G136, polyA ଏକକ ଅକ୍ଷର ଆମିନୋ ଏସିଡ୍ ପ୍ରତୀକ ଏବଂ ଅବଶିଷ୍ଟ ସଂଖ୍ୟା ଦ୍ୱାରା ସୂଚିତ |ଇନସେଟଗୁଡ଼ିକ NT, 2Rep, ଏବଂ CT ଡୋମେନରୁ ମନୋନୀତ ଅବଶିଷ୍ଟ ସମୟ ପାଇଁ ସିଗନାଲ ତୀବ୍ରତାର ନିର୍ଭରଶୀଳତା ଦର୍ଶାଏ |b His-NT2RepCT ହାଇଡ୍ରୋଜେଲଗୁଡିକର କଠିନ-ସ୍ଥିତ ରେଡିଓଫ୍ରିକ୍ୱେନ୍ସି (RFDR) ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରା |RFDR ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରାରେ ଦେଖାଯାଇଥିବା Cα / Cβ ଅବଶିଷ୍ଟଗୁଡ଼ିକର ସଂଶୋଧନ ମଡେଲ୍ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ରାସାୟନିକ ପରିବର୍ତ୍ତନ ଏବଂ ପରିସଂଖ୍ୟାନ 82,83 ଏବଂ ସେମାନଙ୍କର ଦ୍ secondary ିତୀୟ ସଂରଚନା ସହିତ ତୁଳନା କରାଯାଏ |SSB - ଘୂର୍ଣ୍ଣନ କରୁଥିବା ସାଇଡବ୍ୟାଣ୍ଡ |c 36 ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ 37 ° C ରେ ଇନକ୍ୟୁବେସନ ସମୟରେ 15N-HSQC 10 mg / mL NT ସମାଧାନର ଏକ-ଡାଇମେନ୍ସନାଲ୍ ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରା |ଇନସେଟ ସମୟ ସହିତ ଭଲ୍ୟୁମେଟ୍ରିକ ତୀବ୍ରତା ଦେଖାଏ |d NT ହାଇଡ୍ରୋଜେଲଗୁଡିକର କଠିନ ସ୍ଥିତି RFDR ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରା |Cα / Cβ ଅବଶିଷ୍ଟଗୁଡ଼ିକର ସମ୍ପର୍କ ଏବଂ RFDR ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରାରେ ଦେଖାଯାଇଥିବା ସେମାନଙ୍କର ଦ୍ secondary ିତୀୟ ସଂରଚନା ସୂଚିତ କରାଯାଇଛି |e ଜିପର୍ ଡାଟାବେସ୍ (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) ରୁ NT45.79 ଫାଇବ୍ରିଲେସନ୍ ପ୍ରବୃତ୍ତି ପ୍ରୋଫାଇଲ୍ ଉପରେ ଆଧାର କରି |ହେକ୍ସାପେପ୍ଟାଇଡ୍ର ସ୍ପେସାଲ୍ ବିଜୁଳି ଶିଫ୍ଟ ୱିଣ୍ଡୋର ରୋଜେଟା ଶକ୍ତି kcal / mol ରେ ଦର୍ଶାଯାଇଛି |ଲାଲ୍ ବାରଗୁଡିକ ଏକ ଉଚ୍ଚ ଫାଇବ୍ରୋସିସ୍ ପ୍ରବୃତ୍ତି ସହିତ ହେକ୍ସାପେପ୍ଟାଇଡ୍ କୁ ସୂଚିତ କରେ (ରୋଜେଟା ଶକ୍ତି -23 kcal / mol ତଳେ; ବିନ୍ଦୁ ରେଖା ତଳେ) |ସବୁଜ ଦଣ୍ଡଗୁଡିକ ରୋସେଟ୍ଟା ଶକ୍ତି ସହିତ ଖଣ୍ଡଗୁଡ଼ିକୁ ସୂଚାଇଥାଏ ଏବଂ ସେଥିପାଇଁ ଷ୍ଟେରିକ୍ ଜିପର୍ ଗଠନ ହେବାର ସମ୍ଭାବନା କମ୍ |ବିଶ୍ଳେଷଣରୁ (ସ୍ତମ୍ଭ ବିନା) ପ୍ରୋଲାଇନ୍ ଧାରଣ କରିଥିବା ଖଣ୍ଡଗୁଡିକ ବାଦ ଦିଆଗଲା |ବର୍ଗଗୁଡିକ ୱାଲ୍ଟ ଆଲଗୋରିଦମ 81 (https://waltz.switchlab.org) ଦ୍ୱାରା ପୂର୍ବାନୁମାନ କରାଯାଇଥିବା ଆମ୍ଲୋଏଡୋସିସ୍ କ୍ଷେତ୍ରଗୁଡିକ ସୂଚିତ କରେ |NT ର ଆମିନୋ ଏସିଡ୍ ଅବଶିଷ୍ଟଗୁଡିକର କ୍ରମ ଶୀର୍ଷରେ ଅଛି, ଏବଂ β ଦଳୀୟ ସଂରଚନାରେ ମିଳୁଥିବା ଅବଶିଷ୍ଟ ପ୍ରକାରଗୁଡିକ (କଠିନ ସ୍ଥିତ NMR ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରସ୍କୋପି ଦ୍ determined ାରା ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରାଯାଏ) ଲାଲ ରଙ୍ଗରେ ଦେଖାଯାଏ |ପାଞ୍ଚଟି NT α- ହେଲିକେସର ସ୍ଥିତିକୁ (H1-H5) 28 ଭାବରେ ନାମିତ କରାଯାଇଛି |
PH <6.5 ରେ, HT ଉତ୍ତାପ- କିମ୍ବା ୟୁରିଆ ଦ୍ ind ାରା ନିର୍ମିତ ଡେନାଟେରେସନ୍ ପ୍ରତିରୋଧକ ହୋଇ ଡାଇମେରାଇଜ୍ ହୁଏ |NT ଡାଇମେରାଇଜେସନ୍ ଏବଂ ସ୍ଥିରତା କିପରି ଜେଲେସନ୍ ଉପରେ ପ୍ରଭାବ ପକାଇଥାଏ, 100 ମିଗ୍ରା / ମିଲ୍ NT ଧାରଣ କରିଥିବା ସମାଧାନଗୁଡିକ pH 8, 7, ଏବଂ 6 ରେ ଭିଆଲ୍ ଇନଭର୍ସନ୍ ଟେଷ୍ଟ ବ୍ୟବହାର କରି ନିୟନ୍ତ୍ରଣ କରାଯାଇଥିଲା |PH 8 ଏବଂ 7 ରେ ଇନକ୍ୟୁବେଡ୍ ହୋଇଥିବା NT ନମୁନାଗୁଡିକ 30 ମିନିଟ୍ ପରେ 37 ° C ରେ ଗେଲଡ୍ ହୋଇଥିଲା, କିନ୍ତୁ pH 8 ଜେଲ୍ ସ୍ପଷ୍ଟ ରହିଲାବେଳେ pH 7 ଜେଲ୍ ଏକ ଦୃଶ୍ୟମାନ ପରିମାଣ ଦେଖାଇଲା (ଚିତ୍ର 5a) |ଏହାର ବିପରୀତରେ, pH 6 ରେ HT ଧାରଣ କରିଥିବା ଏକ ସମାଧାନ ଏକ ଜେଲ୍ ସୃଷ୍ଟି କଲା ନାହିଁ, ଏବଂ 37 ° C ରେ 20 ମିନିଟ୍ ପରେ ଏକ ବୃହତ୍ ବୃଷ୍ଟିପାତ ଦେଖାଯାଏ |ଏହା ସୂଚିତ କରେ ଯେ ମୋନୋମର ତୁଳନାରେ ନିଜେ ଏବଂ / କିମ୍ବା ସେମାନଙ୍କର ଉଚ୍ଚ ସ୍ଥିରତା ଜିଲେସନକୁ ରୋକିଥାଏ |PH 7 ଏବଂ 6 ରେ NT ପାଇଁ ଏକ ଘୂର୍ଣ୍ଣିବଳୟ ସୃଷ୍ଟି ହେବାର ଆଶା କରାଯାଇନଥିଲା, କାରଣ ଏହା ଜଣାଯାଇଛି ଯେ NT 200 ମିଗ୍ରା / ମିଲି 27 ରେ ଦ୍ରବୀଭୂତ ହୁଏ, ଉତ୍ତାପ ହ୍ରାସ ପରେ ସହଜରେ ରିଫୋଲ୍ଡ ହୁଏ ଏବଂ ନିମ୍ନ ମୂଲ୍ୟରେ α- ହେଲିକ୍ସ ମଧ୍ୟ ରଖେ | pH 18. ଏହି ଅସଙ୍ଗତି ପାଇଁ ଏକ ସମ୍ଭାବ୍ୟ ବ୍ୟାଖ୍ୟା ହେଉଛି ଯେ ପୂର୍ବରୁ ରିପୋର୍ଟ ହୋଇଥିବା ପରୀକ୍ଷଣଗୁଡିକ କୋଠରୀ ତାପମାତ୍ରାରେ କିମ୍ବା ତଳେ କିମ୍ବା ଅପେକ୍ଷାକୃତ କମ୍ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଏକାଗ୍ରତା 16,18,19 ରେ କରାଯାଇଥିଲା |
37 ° C ରେ ଇନକ୍ୟୁବେସନ ପରେ pH 8, 7, 6 ଏବଂ 154 mM NaCl (pH 8) ରେ NT vial inversion test (100 mg / mL) |b NT CD ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରା ଯଥାକ୍ରମେ 154 mM NaF ଏବଂ 154 mM NaCl ସହିତ |222 nm ରେ ମୋଲାର ଏଲିପଟିସିଟି ପ୍ରାକୃତିକ ଫୋଲ୍ଡର ଅନୁପାତରେ ରୂପାନ୍ତରିତ |c NT inversion assay (100 mg / mL) NT * (37 ° C ଏବଂ 60 ° C), NTA72R (37 ° C), ଏବଂ His-NT-L6 (37 ° C ଏବଂ 60 ° C) |d NT ମ୍ୟୁଟାଣ୍ଟ NT *, NTA72R, ଏବଂ His-NT-L6 ର CD ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରା |222 nm ରେ ମୋଲାର ଏଲିପଟିସିଟି ପ୍ରାକୃତିକ ଫୋଲ୍ଡର ଅନୁପାତରେ ରୂପାନ୍ତରିତ |e NTFlSp, NTMiSp ର ବିପରୀତ ପରୀକ୍ଷଣ ଏବଂ NTMiSp (100 mg / mL) ହ୍ରାସ |ମାପ ଦଣ୍ଡ 5 ମିମି |NT, NTFlSp, NTMiSp ର f CD ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରା ଏବଂ NTMiSp କୁ ହ୍ରାସ କଲା |222 nm ରେ ମୋଲାର ଏଲିପଟିସିଟି ପ୍ରାକୃତିକ ଫୋଲ୍ଡର ଅନୁପାତରେ ରୂପାନ୍ତରିତ |25 ° C ଏବଂ 95 ° C ରେ ପୂର୍ଣ୍ଣ NT ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରା ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 8 ରେ ଦର୍ଶାଯାଇଛି |
ଶାରୀରିକ ଲୁଣର ଏକାଗ୍ରତା NT ସବନିଟ୍ ମଧ୍ୟରେ ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋଷ୍ଟାଟିକ୍ ପାରସ୍ପରିକ କ୍ରିୟା ଏବଂ ନିମ୍ନ pH18 କୁ NT ସ୍ଥାନାନ୍ତରର ଡାଇମେରାଇଜେସନ୍ ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରେ |ଆମେ ଜାଣିଲୁ ଯେ 154 ମିଟର NaCl ଏବଂ NaF ର ଉପସ୍ଥିତି ପ୍ରକୃତରେ ଜେଲେସନକୁ ପ୍ରତିରୋଧ କରିଥିଲା (ଚିତ୍ର 5a, b; ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଡ଼ିମ୍। 2 ବି) ଏବଂ ଏହି ଲୁଣଗୁଡ଼ିକ NT ମନୋମରର ତାପଜ ସ୍ଥିରତା ବ Fig ାଇଲା (ଚିତ୍ର 5 ବି, ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 8) | ।ଏହା ମଧ୍ୟ ସୂଚିତ କରେ ଯେ ସ୍ଥିରତା ପରିବର୍ତ୍ତେ ସ୍ଥିରତା ବୃଦ୍ଧି, ଜେଲ ଗଠନକୁ ରୋକିଥାଏ |
ପ୍ରୋଟିନ୍ ଡାଇମେରାଇଜେସନ୍ ଏବଂ ଜେଲେସନ୍ରେ ସ୍ଥିରତାର ଭୂମିକାକୁ ଅଧିକ ଅନୁସନ୍ଧାନ କରିବାକୁ, ଆମେ ଦୁଇଟି ମ୍ୟୁଟାଣ୍ଟ, NT * ଏବଂ NTA72R ବ୍ୟବହାର କରିଥିଲୁ, ଯାହା ମଧ୍ୟ କମ୍ pH28.30 ରେ ମନୋମେରିକ୍ ରହିଥାଏ |NT * ହେଉଛି ଏକ ଡବଲ୍ ଚାର୍ଜ ରିଭର୍ସାଲ୍ ମ୍ୟୁଟାଣ୍ଟ ଯେଉଁଥିରେ ମୋନୋମରର ସ୍ପଷ୍ଟ ଡିପୋଲାର୍ ଚାର୍ଜ ବଣ୍ଟନ ଫ୍ଲାଟ ହୋଇଛି, ଯାହା ଡାଇମେରାଇଜେସନ୍ କୁ ରୋକିଥାଏ ଏବଂ ମୋନୋମର ସ୍ଥିରତାକୁ ବହୁଗୁଣିତ କରିଥାଏ |NTA72R ହେଉଛି ଏକ ଚାର୍ଜ ହୋଇଥିବା ଡିପୋଲ୍, କିନ୍ତୁ ଆର୍ଗ-ପ୍ରତିସ୍ଥାପିତ ଆଲା ଡାଇମର୍ ସୀମାରେ ଅବସ୍ଥିତ, ତେଣୁ ପରିବର୍ତ୍ତନଗୁଡିକ ଡାଇମେରାଇଜେସନ୍ ପାଇଁ ଆବଶ୍ୟକ ସବନିଟ୍ ପାରସ୍ପରିକ କାର୍ଯ୍ୟରେ ବାଧା ସୃଷ୍ଟି କରେ |37 ° C ରେ ଇନକ୍ୟୁବେସନ ପରେ, NT * ଏକ ହାଇଡ୍ରୋଜେଲ ସୃଷ୍ଟି କରିନଥିଲାବେଳେ NTA72R 15 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ ଏକ ଅସ୍ପଷ୍ଟ ଜେଲ୍ ଗଠନ କରିଥିଲା (ଚିତ୍ର 5c) |ଯେହେତୁ ଉଭୟ NT * ଏବଂ NTA72R ହ୍ରାସ କରିପାରିବ ନାହିଁ କିନ୍ତୁ ମୋନୋମର ସ୍ଥିରତା (ଚିତ୍ର 5d) ରେ ଭିନ୍ନ, ଏହି ଫଳାଫଳଗୁଡିକ ଦୃ strongly ଭାବରେ ସୂଚିତ କରେ ଯେ ଉଚ୍ଚ ଥର୍ମୋଡାଇନାମିକ୍ ସ୍ଥିରତା NT କୁ ଗେଲିଂରୁ ରୋକିଥାଏ |ଏହା ମଧ୍ୟ ସମର୍ଥିତ ଯେ ଉଚ୍ଚ ତାପମାତ୍ରାରେ ଅସ୍ଥିର ଥିବାବେଳେ HT * ଏକ ଜେଲ୍ ସୃଷ୍ଟି କରେ (60 ° C ରେ 8 ମିନିଟ୍ ପରେ; ଚିତ୍ର 5c) |ଏହା ପୂର୍ବରୁ ଦେଖାଯାଇଛି ଯେ NT ରେ ମିଥୋନିନ୍ ର ଅଧିକ ପରିମାଣ ଏହାର ପ୍ରାକୃତିକ ଫୋଲ୍ଡିଂକୁ ତରଳାଇଥାଏ ଏବଂ six ଟି ମେଟରୁ ଲିୟୁ ପ୍ରତିସ୍ଥାପନକାରୀ (ଏଠାରେ His-NT-L6 ଭାବରେ କୁହାଯାଏ) NT46 ମୋନୋମରକୁ ଦୃ strongly ଭାବରେ ସ୍ଥିର କରିଥାଏ |NT ଜେଲ ଗଠନ ପାଇଁ ଗଠନମୂଳକ ନମନୀୟତା ଆବଶ୍ୟକ ବୋଲି ଧାରଣା ଉପରେ ଆଧାର କରି, ଆମେ ଜାଣିଲୁ ଯେ His-NT-L6 ସ୍ଥିର ମ୍ୟୁଟାଣ୍ଟ 37 ° C ରେ ଚିତ୍ର ହୋଇନାହିଁ (ଚିତ୍ର 5c, d) |ଅବଶ୍ୟ, His-NT-L6 ମଧ୍ୟ 60 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ 60 ° C ରେ ଇନକ୍ୟୁବେସନ ଉପରେ ଏକ ଜେଲ୍ ଗଠନ କଲା (ଚିତ୍ର 5c) |
NT- ସିଟ୍ ସଂରଚନାରେ ପରିଣତ ହେବା ଏବଂ ହାଇଡ୍ରୋଜେଲ୍ ଗଠନ କରିବାର NT ର କ୍ଷମତା କେତେକଙ୍କ ପାଇଁ ପ୍ରଯୁଜ୍ୟ ଦେଖାଯାଏ କିନ୍ତୁ ସ୍ପିଡ୍ରୋଏନ୍ ର ସମସ୍ତ NT ଡୋମେନ୍ ନୁହେଁ |ବିଭିନ୍ନ ରେଶମ ପ୍ରକାର ଏବଂ ସ୍ପାଇଡର ପ୍ରଜାତିର NT, ଟ୍ରାଇକୋନେଫିଲା କ୍ଲାଭାଇପ୍ସ (NTFlSp), ଅପେକ୍ଷାକୃତ କମ୍ ମିଥୋନିନ୍ ବିଷୟବସ୍ତୁ ଏବଂ ଉଚ୍ଚ ତାପଜ ସ୍ଥିରତା ସତ୍ତ୍ g େ ଜେଲ୍ ଗଠନ କରିଥିଲେ (ଚିତ୍ର 5e, f ଏବଂ ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ସାରଣୀ 2) |ଏହାର ବିପରୀତରେ, ସ୍ୱଳ୍ପ ତାପଜ ସ୍ଥିରତା ଏବଂ ଉଚ୍ଚ ମିଥୋନିନ୍ ବିଷୟବସ୍ତୁ ସହିତ ଆରେନାସ୍ ଭେଣ୍ଟ୍ରିକୋସସ୍ (NTMiSp) ରୁ ଛୋଟ ଆମ୍ପୁଲାର୍ ପ୍ରୋଟିନ୍ ସ୍ପିଡ୍ରଏନ୍ ରୁ NT ହାଇଡ୍ରୋଜେଲ୍ ଗଠନ କରିନଥିଲା (ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଟେବୁଲ୍ ୨ ଏବଂ ଚିତ୍ର 5e, f) |ପରବର୍ତ୍ତୀଟି ଇଣ୍ଟ୍ରାମୋଲେକୁଲାର ଡିସଲଫାଇଡ୍ ବଣ୍ଡର ଉପସ୍ଥିତି ସହିତ ଜଡିତ ହୋଇପାରେ 29,47 |କ୍ରମାଗତ ଭାବରେ, ଯେତେବେଳେ NTMiSp ର ଡିସଲଫାଇଡ୍ ବଣ୍ଡ ହ୍ରାସ ହେଲା, ଏହା 10 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ 37 ° C ରେ ଇନ୍କ୍ୟୁବେସନ ପରେ ଏକ ହାଇଡ୍ରୋଜେଲ ସୃଷ୍ଟି କଲା (ଚିତ୍ର 5e) |ପରିଶେଷରେ, ଏହା ମନେ ରଖିବା ଉଚିତ ଯେ NT ରୁ ଏକ ଜେଲ ଗଠନ ପାଇଁ ଗଠନମୂଳକ ନମନୀୟତା ଏକ ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ, କିନ୍ତୁ ଏକମାତ୍ର ନୁହେଁ |ଅନ୍ୟ ଏକ କାରଣ ଯାହା ପ୍ରାସଙ୍ଗିକ ହୋଇପାରେ, ଆମିଲଏଡ୍ ଫାଇବ୍ରିଲ୍ ଗଠନ କରିବାର ପ୍ରବୃତ୍ତି, ଏବଂ ଜିପର୍ ଡାଟାବେସ୍ ଏବଂ ୱାଲ୍ଟଜ୍ ଆଲଗୋରିଦମ ସହିତ ବିଶ୍ଳେଷଣ ଜେଲ୍ ସୃଷ୍ଟି କରିବାର କ୍ଷମତା ଏବଂ ଆମିଲଏଡୋଜେନିକ୍ ଅଞ୍ଚଳର ଉପସ୍ଥିତି, ଏବଂ ପୂର୍ବାନୁମାନ କରାଯାଇଥିବା ଅଞ୍ଚଳଗୁଡିକ ମଧ୍ୟରେ ସମ୍ପର୍କ ଦେଖାଇଲା | ଷ୍ଟେରିକ୍ ଜିପର୍ ଗଠନ କରିବାକୁ |ସେଠାରେ ଏକ ସମ୍ପର୍କ ଥିଲା (ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଟେବୁଲ୍ ୨ ଏବଂ ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 9) |
ଫାଇବ୍ରିଲ୍ ଗଠନ ଏବଂ ଅନୁକୂଳ ଅବସ୍ଥାରେ ଜେଲ୍ ଗଠନ କରିବାର NT ର କ୍ଷମତା ଆମକୁ ଅନୁମାନ କରିବାକୁ ଲାଗିଲା ଯେ ଅନ୍ୟ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଖଣ୍ଡଗୁଡ଼ିକ ସହିତ NT ଫ୍ୟୁଜନ୍ ଫ୍ୟୁଜନ୍ ପାର୍ଟନରମାନଙ୍କର ସମ୍ପୂର୍ଣ୍ଣ କାର୍ଯ୍ୟ ସହିତ ଜେଲ୍ ଗଠନ କରିପାରିବ |ଏହାକୁ ପରୀକ୍ଷା କରିବା ପାଇଁ, ଆମେ ଯଥାକ୍ରମେ NT ର C- ଟର୍ମିନାସରେ ସବୁଜ ଫ୍ଲୋରୋସେଣ୍ଟ୍ ପ୍ରୋଟିନ୍ (GFP) ଏବଂ ପ୍ୟୁରିନ୍ ନ୍ୟୁକ୍ଲିଓସାଇଡ୍ ଫସଫୋରାଇଲେଜ୍ (PNP) ପ୍ରବର୍ତ୍ତନ କଲୁ |ଫଳସ୍ୱରୂପ ଫ୍ୟୁଜନ୍ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଗୁଡିକ ଇ-କୋଲିରେ ଅତ୍ୟଧିକ ଉଚ୍ଚ ଅମଳ ସହିତ ପ୍ରକାଶ କରାଯାଇଥିଲା (ଯଥାକ୍ରମେ His-NT-GFP ଏବଂ His-NT-PNP ପାଇଁ 150 ମିଗ୍ରା / L ଏବଂ 256 ମିଗ୍ରା / L ଶେକ୍ ଫ୍ଲାସ୍କ ସଂସ୍କୃତି), ଯାହା ଦେଖାଯାଇଛି ତାହା ସହିତ ସମାନ | ଅନ୍ୟାନ୍ୟ ପ୍ରୋଟିନ୍ ପାଇଁ NT Ref ରେ ମିଶ୍ରିତ |30. ତାଙ୍କର- NT-GFP (300mg / mL) ଏବଂ His-NT-PNP (100mg / mL) ଫ୍ୟୁଜନ୍ ପ୍ରୋଟିନ୍ 2 ଘଣ୍ଟା 6.5 ଘଣ୍ଟା ପରେ 37 ° C ରେ ଜେଲ୍ ଗଠନ କରିଥିଲେ ଏବଂ ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ କଥା ହେଉଛି, GFP ଭଗ୍ନାଂଶ ଅପରିବର୍ତ୍ତିତ ରହିଲା |ଜେଲେସନ୍ ପରେ ଦେଖାଯାଏ, ପ୍ରାରମ୍ଭିକ ଫ୍ଲୋରୋସେନ୍ସ ତୀବ୍ରତାର 70% ସହିତ ଜେଲେସନ୍ ପରେ ବାକି ରହିଲା (ଚିତ୍ର 6a) |ତାଙ୍କ- NT-PNP ସମାଧାନ ଏବଂ ଜେଲରେ PNP କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ମାପିବା ପାଇଁ, ଆମକୁ NT ସହିତ ଫ୍ୟୁଜନ୍ ପ୍ରୋଟିନ୍ କୁ ମିଶ୍ରିତ କରିବାକୁ ପଡିଲା କାରଣ ଶୁଦ୍ଧ ପ୍ରସ୍ତୁତିର ଏନଜାଇମାଟିଭ୍ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ଗେଲିଂ ଏକାଗ୍ରତାରେ ଅନୁସନ୍ଧାନର ଚିହ୍ନଟ ପରିସର ବାହାରେ ଥିଲା |0.01 ମିଗ୍ରା / ମିଏଲ୍ His-NT-PNP ଏବଂ 100 ମିଗ୍ରା / ମି.ଏଲ୍ NT ଧାରଣ କରିଥିବା ମିଶ୍ରଣ ସହିତ ଗଠିତ ଜେଲ୍ ପ୍ରିନ୍କ୍ୟୁବେଡ୍ ନମୁନାଗୁଡିକର ପ୍ରାରମ୍ଭିକ ଏନଜାଇମାଟିଭ୍ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପର 65% ରଖିଛି (ଚିତ୍ର 6b) |ମାପ ସମୟରେ ଜେଲ୍ ଅକ୍ଷୁର୍ଣ୍ଣ ରହିଲା (ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 10) |
His-NT-GFP (300 mg / mL) ର ଜେଲେସନ୍ ପୂର୍ବରୁ ଏବଂ ପରେ ଏକ ଆପେକ୍ଷିକ ଫ୍ଲୋରୋସେନ୍ସ ତୀବ୍ରତା ଏବଂ ଦୃଶ୍ୟମାନ ଏବଂ UV ଆଲୋକରେ His-NT-GFP ହାଇଡ୍ରୋଜେଲ (300 ମିଗ୍ରା / ଏମଏଲ୍) ଧାରଣ କରିଥିବା ଓଲଟା ଭିଆଲ୍ |ପଏଣ୍ଟଗୁଡିକ ବ୍ୟକ୍ତିଗତ ମାପ ଦେଖାଏ (n = 3), ତ୍ରୁଟି ଦଣ୍ଡିକା ମାନକ ବିଘ୍ନ ଦେଖାଏ |ହାରାହାରି ମୂଲ୍ୟ ଏରର୍ ବାର୍ ଗୁଡିକରେ ଦେଖାଯାଏ |b PNP କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ଫ୍ଲୋରୋମେଟ୍ରିକ୍ ବିଶ୍ଳେଷଣ ଦ୍ NT ାରା NT (100 ମିଗ୍ରା / ମିଲି) ଏବଂ 0.01 ମିଗ୍ରା / ମିଲ୍ ତାଙ୍କ- NT-PNP ଏବଂ 100 ମିଗ୍ରା / ମିଲ୍ ନୂତନ ତାଇୱାନ ଡଲାର ଧାରଣ କରିଥିବା ମିଶ୍ରଣ ଏବଂ ଜେଲ ବ୍ୟବହାର କରି ପ୍ରାପ୍ତ ହୋଇଥିଲା |ଇନ୍ସେଟରେ ଏକ ଓଲଟା ଭିଆଲ୍ ଦେଖାଯାଏ ଯେଉଁଥିରେ ହାଇଡ୍ରୋଜେଲ୍ ଥାଏ ଯାହାକି His-NT-PNP (5 mm ସ୍କେଲ୍ ବାର୍) ଧାରଣ କରିଥାଏ |
ଏଠାରେ, ଆମେ 37 ° C ରେ ଏକ ପ୍ରୋଟିନ୍ ସଲ୍ୟୁସନ୍ ଇନ୍କ୍ୟୁବ୍ କରି NT ଏବଂ ଅନ୍ୟାନ୍ୟ ରେକମ୍ବିନାଣ୍ଟ ସ୍ପିଡ୍ରୋଏନ୍ ପ୍ରୋଟିନ୍ ରୁ ହାଇଡ୍ରୋଜେଲ ଗଠନ ବିଷୟରେ ରିପୋର୍ଟ କରୁ |ଆମେ ଦେଖାଉଛୁ ଯେ ଜେଲେସନ୍ α- ହେଲିକ୍ସର β- ସ୍ତରରେ ରୂପାନ୍ତର ଏବଂ ଆମିଲଏଡ୍ ପରି ଫାଇବ୍ରିଲ୍ ଗଠନ ସହିତ ଜଡିତ (ଚିତ୍ର 3 ଏବଂ 4) |ଏହି ଅନୁସନ୍ଧାନ ଆଶ୍ଚର୍ଯ୍ୟଜନକ, କାରଣ NT ଗୁଡିକ ଗ୍ଲୋବୁଲାର ପାଞ୍ଚ-ହେଲିକ୍ସ ବଣ୍ଡଲଗୁଡିକ ଅତ୍ୟଧିକ ଉଚ୍ଚ ଦ୍ରବଣୀୟତା ଏବଂ ଏକାଗ୍ରତାରେ ଉଚ୍ଚ ସ୍ଥିରତା ପାଇଁ> 200 ମିଗ୍ରା / ମିଏଲ 4 ° C ରେ ଅନେକ ଦିନ ପାଇଁ ଜଣାଶୁଣା |ଏଥିସହ, µM ରେ କମ୍ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଏକାଗ୍ରତାରେ ଉତ୍ତାପ ବିଭାଜନ ପରେ NT ଗୁଡିକ ସହଜରେ ରିଫୋଲ୍ଡ ହୁଏ |ଆମର ଫଳାଫଳ ଅନୁଯାୟୀ, ଫାଇବ୍ରିଲ୍ ଗଠନ ପାଇଁ> 10 ମିଗ୍ରା / ମି.ଏଲ୍ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଏକାଗ୍ରତା ଏବଂ ସାମାନ୍ୟ ଉଚ୍ଚତର ତାପମାତ୍ରା (ଚିତ୍ର 1) ର ମିଶ୍ରଣ ଆବଶ୍ୟକ |ଏହା ଧାରଣା ସହିତ ସମାନ ଅଟେ ଯେ ଆମ୍ଲୋଏଡ୍ ଫାଇବ୍ରିଲ୍ ଗ୍ଲୋବୁଲାର୍ ଫୋଲ୍ଡ୍ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଗୁଡ଼ିକରୁ ସୃଷ୍ଟି ହୋଇପାରେ ଯାହା ଶାରୀରିକ ପରିସ୍ଥିତିରେ ତାପଜ ପରିବର୍ତ୍ତନ ହେତୁ ଆଂଶିକ ଖୋଲା ଅବସ୍ଥାରେ ଥାଏ |ଏହି ରୂପାନ୍ତର କରୁଥିବା ପ୍ରୋଟିନଗୁଡିକର ଉଦାହରଣରେ ଇନସୁଲିନ୍ 49,50, β2- ମାଇକ୍ରୋଗ୍ଲୋବୁଲିନ୍, ଟ୍ରାନଷ୍ଟାଇରେଟିନ୍ ଏବଂ ଲାଇସୋଜାଇମ୍ 51,52,53 ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତ |ଯଦିଓ NT ଏହାର ମୂଳ ଅବସ୍ଥାରେ ଏକ α- ହେଲିକ୍ସ, ପ୍ରାୟ 65% ପଲିପେପ୍ଟାଇଡ୍ ଶୃଙ୍ଖଳ ଷ୍ଟେରିକ୍ ଜିପର୍ ଗଠନ (ଚିତ୍ର 4e) 45 ସହିତ ସୁସଙ୍ଗତ |ଯେହେତୁ ମୋନୋମର ଗତିଶୀଳ ମୋବାଇଲ୍ 46 ଅଟେ, ଏହା ମଧ୍ୟମ ସମ୍ଭାବ୍ୟ ଉତ୍ତାପ ତାପମାତ୍ରାରେ ଏହି ସମ୍ଭାବ୍ୟ ଆମ୍ଲୋଏଡୋଜେନିକ୍ ଅଞ୍ଚଳଗୁଡିକୁ ପ୍ରକାଶ କରିପାରିବ ଏବଂ ମୋଟ ପ୍ରୋଟିନର ଅଧିକ ଏକାଗ୍ରତା ଆମିଲଏଡ୍ ଫାଇବ୍ରିଲ୍ ଗଠନ ପାଇଁ ଏକ ଗୁରୁତ୍ concent ପୂର୍ଣ୍ଣ ଏକାଗ୍ରତାରେ ପହଞ୍ଚିପାରେ |ଏହି ଯୁକ୍ତି ଅନୁସରଣ କରି, ଆମେ ସ୍ପିଡ୍ରୋଏନ୍ ଏକାଗ୍ରତା ଏବଂ ଜେଲେସନ୍ ସମୟ (ଚିତ୍ର 1c) ମଧ୍ୟରେ ଏକ ନକାରାତ୍ମକ ସମ୍ପର୍କ ପାଇଲୁ, ଏବଂ ଯଦି ମୋନୋମେରିକ୍ NT ରୂପାନ୍ତର ପରିବର୍ତ୍ତନ (NT *, His-NT-L6) କିମ୍ବା ଲୁଣ ଯୋଗ ଦ୍ୱାରା ସ୍ଥିର ହୋଇଯାଏ, ତେବେ ଏହାକୁ ପ୍ରତିରୋଧ କରିପାରିବ | ଗଠନ ହାଇଡ୍ରୋଜେଲ (ଚିତ୍ର 5) |
ଅଧିକାଂଶ କ୍ଷେତ୍ରରେ, ଆମିଲଏଡ୍ ଫାଇବ୍ରିଲଗୁଡିକ ଏକ ସମାଧାନ ଭାବରେ ସମାଧାନରୁ ଅଦୃଶ୍ୟ ହୋଇଯାଏ, କିନ୍ତୁ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ଅବସ୍ଥାରେ ସେମାନେ ହାଇଡ୍ରୋଜେଲ 555,56,57 ସୃଷ୍ଟି କରିପାରନ୍ତି |ହାଇଡ୍ରୋଜେଲ-ଗଠନକାରୀ ଫାଇବ୍ରିଲଗୁଡିକର ସାଧାରଣତ a ଏକ ଉଚ୍ଚ ଦିଗ ଅନୁପାତ ରହିଥାଏ ଏବଂ ମଲିକୁଲାର ଏଣ୍ଟାଙ୍ଗଲେମେଣ୍ଟ ମାଧ୍ୟମରେ ସ୍ଥିର ତିନି-ଡାଇମେନ୍ସନାଲ ନେଟୱାର୍କ ଗଠନ କରିଥାଏ, 55,58 ଆମର ଫଳାଫଳ ସହିତ ସମାନ |ଭିଟ୍ରୋରେ ହାଇଡ୍ରୋଜେଲ ଗଠନ ପାଇଁ, ପ୍ରୋଟିନ୍ ପ୍ରାୟତ fully ସମ୍ପୂର୍ଣ୍ଣ କିମ୍ବା ଆଂଶିକ ଖୋଲାଯାଏ, ଉଦାହରଣ ସ୍ୱରୂପ, ଜ organic ବ ଦ୍ରବଣ, ଉଚ୍ଚ ତାପମାତ୍ରା (70–90 ° C) ଏବଂ / କିମ୍ବା ନିମ୍ନ pH (1.5-3.0) 59,60,61,62 |ଏଠାରେ ବର୍ଣ୍ଣିତ ସ୍ପିଡ୍ରୋଏନ୍ ହାଇଡ୍ରୋଜେଲଗୁଡିକ କଠିନ ପ୍ରକ୍ରିୟାକରଣ ଆବଶ୍ୟକ କରେ ନାହିଁ କିମ୍ବା ହାଇଡ୍ରୋଜେଲଗୁଡିକ ସ୍ଥିର କରିବା ପାଇଁ କ୍ରସ୍-ଲିଙ୍କ୍ ଏଜେଣ୍ଟଗୁଡିକ ଆବଶ୍ୟକ କରେ ନାହିଁ |
ଏହା ପୂର୍ବରୁ ରିପୋର୍ଟ କରାଯାଇଛି ଯେ ରେଶମ ଘୂର୍ଣ୍ଣନ ସମୟରେ β- ଶୀଟ୍ ସୁଇଚିଙ୍ଗ୍ ପରି ଦେଖାଯାଉଥିବା ସ୍ପାଇଡ୍ରଏନ୍ ପୁନରାବୃତ୍ତି ଏବଂ QD ଗୁଡିକ ହାଇଡ୍ରୋଜେଲ ଗଠନ କରନ୍ତି |ଆମର ଅନୁସନ୍ଧାନ ତୁଳନାରେ, ଇନକ୍ୟୁବେସନ ସମୟ ଏବଂ / କିମ୍ବା ଇନକ୍ୟୁବେସନ ତାପମାତ୍ରା ଯଥାକ୍ରମେ ଅଧିକ କିମ୍ବା ଅଧିକ ଥିଲା, ଏବଂ ଫଳାଫଳ ହାଇଡ୍ରୋଜେଲଗୁଡିକ ପ୍ରାୟତ op ଅସ୍ପଷ୍ଟ ଥିଲା (ଚିତ୍ର 7 ଏବଂ ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ସାରଣୀ 1) 37, 38, 63, 64, 65, 66, 67, 68 , 69. ଫାଷ୍ଟ ଜେଲ୍ ସମୟ ବ୍ୟତୀତ, NT ହାଇଡ୍ରୋଜେଲ୍> 300 ମିଗ୍ରା / ମିଏଲ୍ (30%) ଅନ୍ୟ ସମସ୍ତ ବର୍ଣ୍ଣିତ ରେକମ୍ବିନାଣ୍ଟ ସ୍ପାଇଡର୍ ରେଶମ ପ୍ରୋଟିନ୍ ହାଇଡ୍ରୋଜେଲ, ଏବଂ ଜେଲାଟିନ୍, ଆଲଜିନେଟ୍ (2%), ଅଗର (0.5%) ଠାରୁ ଅଧିକ ବର୍ଣ୍ଣିତ | ) ଏବଂ କୋଲାଜେନ୍ |(0.6%) (ଚିତ୍ର 7 ଏବଂ ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଟେବୁଲ୍ 1 ଏବଂ 3) 37,39,66,67,68,69,70,71,72,73,74
ଏହି ଅଧ୍ୟୟନରେ ହାଇଡ୍ରୋଜେଲଗୁଡିକର ଜେଲ୍ ସମୟ ଏବଂ ଇଲାଷ୍ଟିକ୍ ମଡ୍ୟୁଲସ୍ ଅନ୍ୟ ସ୍ପିଡ୍ରୋଏନ୍-ଆଧାରିତ ହାଇଡ୍ରୋଜେଲ ଏବଂ ମନୋନୀତ ପ୍ରାକୃତିକ ହାଇଡ୍ରୋଜେଲ ସହିତ ତୁଳନା କରାଯାଇଥିଲା |ଜେଲେସନ୍ ଅବସ୍ଥାର ବର୍ଣ୍ଣନା ସହିତ ରେଫରେନ୍ସ ଦିଆଯାଏ |ଏପିଏସ୍ ଆମୋନିୟମ୍ ପର୍ସଲଫେଟ୍, କୋଠରୀ ତାପମାତ୍ରା |ତଥ୍ୟ 37, 38, 39, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74
ସ୍ପାଇଡ୍ରୋଏନ୍ ଷ୍ଟୋରେଜ୍ ସମୟରେ ଗେଲିଂରୁ ରକ୍ଷା ପାଇବା ପାଇଁ ସ୍ପାଇଡର୍ସ ବିକଶିତ ହୋଇଥିବା ପରି ଦେଖାଯାଏ |ରେଶମ ଗ୍ରନ୍ଥିରେ ପ୍ରୋଟିନର ଅଧିକ ଏକାଗ୍ରତା ସତ୍ତ୍ the େ, ଟର୍ମିନାଲ୍ ଡୋମେନ୍ ସହିତ ଜଡିତ ବୃହତ ପୁନରାବୃତ୍ତି ଅଞ୍ଚଳର ଅର୍ଥ ହେଉଛି ଯେ ଗ୍ରନ୍ଥିରେ NT ଏବଂ CT ର ସ୍ପଷ୍ଟ ଏକାଗ୍ରତା ଏହି ଅଧ୍ୟୟନର ସୀମାରେ ପ୍ରାୟ 10-20 ମିଗ୍ରା / ମିଲି ସହିତ ଅନୁରୂପ ଅଟେ |ଭିଟ୍ରୋ ଦେଖାଯାଇଥିବା ହାଇଡ୍ରୋଜେଲ ଗଠନ ପାଇଁ ଆବଶ୍ୟକ |ଏଥିସହ, ରେଶମ ଗ୍ରନ୍ଥିଗୁଡିକ ପରି ଲୁଣର ସମାନ ଏକାଗ୍ରତା 16 ସ୍ଥିର NT ସ୍ଥିର କଲା (ଚିତ୍ର 5b) |ଇ.କୋଲି ସାଇଟୋସୋଲରେ NT ରୂପାନ୍ତର ଅଧ୍ୟୟନ କରାଯାଇଛି ଏବଂ ଭିଟ୍ରୋରେ ପରୀକ୍ଷା କରାଯିବା ଅପେକ୍ଷା ଅଧିକ ଦୃ fold ଭାବରେ ଫୋଲ୍ଡ୍ ହୋଇଥିବା ଜଣାପଡିଛି, ଏହା ସୂଚିତ କରେ ଯେ ଲୁଣ କିମ୍ବା ଅନ୍ୟାନ୍ୟ କାରଣ ଭିଭୋରେ ଏହାର ମିଶ୍ରଣକୁ ରୋକିଥାଏ |ତଥାପି, NTs ର ଶୀଟ୍ ଫାଇବ୍ରିଲରେ ରୂପାନ୍ତର କରିବାର କ୍ଷମତା ଚିଲାଣ୍ଟ ଗଠନ ପାଇଁ ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ହୋଇପାରେ ଏବଂ ଭବିଷ୍ୟତ ଅଧ୍ୟୟନରେ ଏହାର ଅନୁସନ୍ଧାନ କରାଯିବା ଉଚିତ |
ଏହି ଅଧ୍ୟୟନରେ ଦେଖାଯାଇଥିବା NT-amyloid ପରି ଫାଇବ୍ରିଲ୍ ଏବଂ ହାଇଡ୍ରୋଜେଲ୍ ଗଠନର ଉପନ୍ୟାସ ଦିଗ ସହିତ, ଆମେ ଏହା ମଧ୍ୟ ଦେଖାଉ ଯେ ଏହି ଘଟଣାରେ ବାୟୋଟେକ୍ନୋଲୋଜିକାଲ୍ ଏବଂ ବାୟୋମେଟିକାଲ୍ ପ୍ରୟୋଗ ଥାଇପାରେ (ଚିତ୍ର 8) |ଧାରଣାର ପ୍ରମାଣ ଭାବରେ, ଆମେ NT କୁ GFP କିମ୍ବା PNP ସହିତ ମିଶ୍ରଣ କରି ଦେଖାଇଲୁ ଯେ 37 ° C ରେ ଇନକ୍ୟୁବେଡ୍ ହେବାବେଳେ ଫ୍ୟୁଜନ୍ ପ୍ରୋଟିନ୍ ମଧ୍ୟ ହାଇଡ୍ରୋଜେଲ ସୃଷ୍ଟି କରେ ଏବଂ GFP ଏବଂ PNP ଭଗ୍ନାଂଶଗୁଡିକ ଜେଲେସନ୍ ପରେ ସେମାନଙ୍କର କାର୍ଯ୍ୟକଳାପକୁ ବଜାୟ ରଖନ୍ତି (ଚିତ୍ର 6) |ନ୍ୟୁକ୍ଲିଓସାଇଡ୍ ଫସଫୋରାଇଲେସ୍ ହେଉଛି ନ୍ୟୁକ୍ଲିଓସାଇଡ୍ ଆନାଗୁଲ୍ସର ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ଅନୁକ୍ରମଣିକା ସିନ୍ଥେସିସ୍ 75, ଯାହା ଜ oph ବ ଫାର୍ମାସ୍ୟୁଟିକାଲ୍ ଶିଳ୍ପ ପାଇଁ ଆମର ଆବିଷ୍କାରକୁ ପ୍ରାସଙ୍ଗିକ କରିଥାଏ |ଅନୁକୂଳ ପରିସ୍ଥିତିରେ ସ୍ୱଚ୍ଛ ହାଇଡ୍ରୋଜେଲ ଗଠନ କରୁଥିବା ଫ୍ୟୁଜନ୍ ପ୍ରୋଟିନ୍ ପ୍ରକାଶ କରିବାର ସଂକଳ୍ପ, ଏନଜାଇମ୍ ଇମୋମୋବାଇଲାଇଜେସନ୍, ନିୟନ୍ତ୍ରିତ drug ଷଧ ମୁକ୍ତି ଏବଂ ଟିସୁ ଇଞ୍ଜିନିୟରିଂ ଭଳି ବିଭିନ୍ନ ପ୍ରୟୋଗ ପାଇଁ ଅନୁକୂଳ ଗୁଣ ସହିତ କାର୍ଯ୍ୟକ୍ଷମ ହାଇଡ୍ରୋଜେଲ ସୃଷ୍ଟି କରିବାକୁ ଅନୁମତି ଦିଏ |ଏହା ସହିତ, NT ଏବଂ NT * ହେଉଛି ଦକ୍ଷ ଅଭିବ୍ୟକ୍ତି ମାର୍କର୍ସ 30, ଯାହାର ଅର୍ଥ ହେଉଛି NT ଏବଂ ଏହାର ପ୍ରକାରଗୁଡିକ ଦ୍ରବଣୀୟ ଫ୍ୟୁଜନ୍ ପ୍ରୋଟିନର ଉଚ୍ଚ-ଥ୍ରୋପଟ୍ ଉତ୍ପାଦନ ଏବଂ 3D ହାଇଡ୍ରୋଜେଲରେ ଇମୋବାଇଲାଇଜଡ୍ ଟାର୍ଗେଟ୍ ପ୍ରୋଟିନ୍ ସୃଷ୍ଟି ପାଇଁ ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇପାରିବ |
NT ଦ୍ରବୀଭୂତ, α- ହେଲିକାଲ୍ ଏବଂ ନିମ୍ନ ଏକାଗ୍ରତା (µM) ଏବଂ 37 ° C ରେ ସ୍ଥିର ଅଟେ |ସମାନ ତାପମାତ୍ରାରେ, କିନ୍ତୁ ବ concent ୁଥିବା ଏକାଗ୍ରତା (> 10 ମିଗ୍ରା / ମିଲି) ରେ, NT ଆମିଲଏଡ୍ ପରି ଫାଇବ୍ରିଲ୍ ସହିତ ଗଠିତ ଜେଲ୍ ଗଠନ କରେ |NT ଫ୍ୟୁଜନ୍ ପ୍ରୋଟିନ୍ ମଧ୍ୟ ସଂପୂର୍ଣ୍ଣ କାର୍ଯ୍ୟକ୍ଷମ ଫ୍ୟୁଜନ୍ ଖଣ୍ଡ ସହିତ ଫାଇବ୍ରିଲାର୍ ଜେଲ୍ ଗଠନ କରେ, ଯାହା ବିଭିନ୍ନ ପ୍ରୋଟିନ୍ଗୁଡ଼ିକୁ NT ବ୍ୟବହାର କରି 3D ହାଇଡ୍ରୋଜେଲରେ ଅସ୍ଥିର ହେବାକୁ ଅନୁମତି ଦିଏ |ତଳ: NT (PDB: 4FBS) ଏବଂ ଫାଇବର ନେଟୱାର୍କର ଚିତ୍ର ଏବଂ ସଂପୃକ୍ତ ପ୍ରୋଟିନ୍ ସଂରଚନା (ଅନୁମାନ କରାଯାଏ ଏବଂ ସ୍କେଲକୁ ଟାଣାଯାଇନଥାଏ, GFP PDB: 2B3Q, 10.2210 / pdb2B3Q / pdb; PNP PDB: 4RJ2, 10.2210 / pdb4RJ2 / pdb) |
ନିର୍ମାଣଗୁଡିକ (ଆମିନୋ ଏସିଡ୍ କ୍ରମ ସହିତ ଏକ ସମ୍ପୂର୍ଣ୍ଣ ତାଲିକା ପାଇଁ ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ସାରଣୀ 4 ଦେଖନ୍ତୁ) ପ୍ଲାସିମ pT7 ରେ କ୍ଲୋନ ହୋଇ ଇ.କୋଲି BL21 (DE3) ରେ ରୂପାନ୍ତରିତ ହେଲା |ଇ-କୋଲି ଇଞ୍ଜିନିୟରିଂ ପ୍ଲାସିମିଡ୍ ଧାରଣ କରିଥିବା ଲୁରିଆ ବ୍ରୋଥରେ କାନାମାଇସିନ୍ (mg ୦ ମିଗ୍ରା / l) ସହିତ ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ରାତିସାରା 30 ° C ଏବଂ 250 rpm ରେ ବୃଦ୍ଧି କରାଯାଇଥିଲା |ଏହା ପରେ ସଂସ୍କୃତି 1/100 କୁ LB ମାଧ୍ୟମରେ କାନାମାଇସିନ୍ ଧାରଣ କରିଥିଲା ଏବଂ OD600 0.8 ରେ ପହଞ୍ଚିବା ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ 30 ° C ଏବଂ 110 rpm ରେ ସଂସ୍କୃତି ପ୍ରାପ୍ତ ହୋଇଥିଲା |NMR ଅଧ୍ୟୟନ ପାଇଁ, ଆଇସୋଟୋପ୍ ସହିତ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଲେବଲ୍ ପାଇଁ 2 ଗ୍ରାମ ଡି-ଗ୍ଲୁକୋଜ୍ 13C (ଆଲଡ୍ରିଚ୍) ଏବଂ 1 ଗ୍ରାମ ଆମୋନିୟମ୍ କ୍ଲୋରାଇଡ୍ 15N (କେମ୍ବ୍ରିଜ୍ ଆଇସୋଟୋପ୍ ଲାବୋରେଟୋରୀ, Inc.) ଧାରଣ କରିଥିବା ଜୀବାଣୁ M9 ସର୍ବନିମ୍ନ ମାଧ୍ୟମରେ ବୃଦ୍ଧି କରାଯାଇଥିଲା |ତାପମାତ୍ରାକୁ 20 ଡିଗ୍ରୀ ସେଲସିୟସକୁ କମ୍ କରନ୍ତୁ ଏବଂ 0.15 ମିଟର ଆଇସୋପ୍ରୋପିଲଥିଆଗାଲାକ୍ଟୋପିରାନୋସାଇଡ୍ (ଅନ୍ତିମ ଏକାଗ୍ରତା) ସହିତ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଅଭିବ୍ୟକ୍ତି ସୃଷ୍ଟି କରନ୍ତୁ |ରାତାରାତି ପ୍ରୋଟିନ୍ ଅଭିବ୍ୟକ୍ତି ପରେ, କୋଷଗୁଡିକ 7278 × g, 4 ° C ରେ 20 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ ଅମଳ ହେଲା |ସେଲ୍ ପେଲେଟଗୁଡିକ 20 ମିଟର Tris-HCl, pH 8 ରେ ପୁନ us ପଠାଗଲା ଏବଂ ପରବର୍ତ୍ତୀ ବ୍ୟବହାର ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ ଫ୍ରିଜ୍ ହେଲା |ଥୱାଡ୍ କୋଷଗୁଡିକ 30 କେପିଏରେ ଏକ ସେଲ୍ ବ୍ୟାଘାତକାରୀ (TS ସିରିଜ୍ ମେସିନ୍, କନଷ୍ଟାଣ୍ଟ ସିଷ୍ଟମ୍ ଲିମିଟେଡ୍, ଇଂଲଣ୍ଡ) ବ୍ୟବହାର କରି ଲାଇସେଡ୍ କରାଯାଇଥିଲା |ତା’ପରେ ଲାଇସେଟ୍ ଗୁଡିକ 25 ° g ରେ 30 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ 4 ° C ରେ ସେଣ୍ଟ୍ରିଫୁଗ୍ କରାଯାଇଥିଲା |NTMiSp ପାଇଁ, ପରେ ପେଲେଟକୁ 2 M ୟୁରିଆ, 20 ମିଟର ଟ୍ରାଇସ୍- HCl, pH 8 ରେ ପୁନ us ପଠାଯାଇଥିଲା ଏବଂ 2 ମିନିଟ୍ (2 s ଅନ୍ / ଅଫ୍, 65%) ପାଇଁ ସୋନିକେଟ୍ କରାଯାଇଥିଲା, ତା’ପରେ ପୁଣି 25,000 xg, 4 ° C ମଧ୍ୟରେ ସେଣ୍ଟ୍ରିଫୁଗ୍ କରାଯାଇଥିଲା | 30 ମିନିଟ୍ଅଲ ern କିକ ତତ୍ତ୍ୱକୁ ଏକ Ni-NTA ସ୍ତମ୍ଭରେ ଧାରଣ କରାଯାଇଥିଲା, 20 ମିଟର ଟ୍ରାଇସ୍- HCl, 2 ମିମି ଇମିଡାଜୋଲ୍, pH 8 ସହିତ ଧୋଇ ଦିଆଗଲା ଏବଂ ଶେଷରେ ପ୍ରୋଟିନ୍ 20 ମିଟର ଟ୍ରାଇସ୍- HCl, 200 ମିମି ଇମିଡାଜୋଲ୍, pH 8. NT2RepCT ସୃଷ୍ଟି କରିବାକୁ ଏବଂ NTCT, ଥ୍ରୋମ୍ବିନ ହଜମ ତାଙ୍କ ଏବଂ NT ମଧ୍ୟରେ ସାଇଟ୍ (ThrCleav) କୁ ପରିଚିତ କରାଏ |ଥ୍ରୋମ୍ବିନ କ୍ଲାଭେଜ୍ ସାଇଟଗୁଡିକ ମଧ୍ୟ His-NT-ThrCleav-2Rep (2Rep ଉତ୍ପାଦନ କରେ), ହିସ୍-ଥିଓରେଡୋକ୍ସିନ୍-ଥ୍ରକ୍ଲିଭ୍-ଏନଟି (NT ଉତ୍ପାଦନ କରେ), ହି-ଥିଓରେଡୋକ୍ସିନ୍-ଥ୍ରକ୍ଲିଭ୍-ସିଟି (ସିଟି ଉତ୍ପାଦନ କରେ), ହି-ଥିରୋଡୋକ୍ସିନ୍-ଥ୍ରକ୍ଲେଭ୍-ଏନଟିରେ ମଧ୍ୟ ଉପସ୍ଥିତ | ।*।ନିର୍ମାଣଗୁଡିକ ଥ୍ରୋମ୍ବିନ (1: 1000) ସହିତ ହଜମ ହୋଇଥିଲା ଏବଂ ରାତାରାତି 4 ° C ରେ 20 ମିମି ଟ୍ରାଇସ୍- HCl, pH 8 ସହିତ ଡାଏଲିଜ୍ କରାଯାଇଥିଲା, 6-8 kDa ର ଏକ ମଲିକୁଲାର୍ ଓଜନ ସୀମା ସହିତ ଏକ ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରା / ପୋର୍ ଡାୟଲିସିସ୍ ମେମ୍ବ୍ରେନ୍ ବ୍ୟବହାର କରି |ଡାୟଲିସିସ୍ ପରେ, ସମାଧାନ ଏକ Ni-NTA ସ୍ତମ୍ଭରେ ଧାରଣ କରାଯାଇଥାଏ ଏବଂ ଆଗ୍ରହର ପ୍ରୋଟିନ୍ ଧାରଣ କରିଥିବା ପ୍ରବାହ ସଂଗ୍ରହ କରାଯାଏ |NTF1Sp ବ୍ୟତୀତ ପ୍ରତ୍ୟେକ ପ୍ରୋଟିନର ବିଲୁପ୍ତ କୋଏଫିସିଣ୍ଟେଣ୍ଟ ବ୍ୟବହାର କରି UV ଅବଶୋଷଣକୁ 280 nm ମାପ କରି ପ୍ରୋଟିନ୍ ଏକାଗ୍ରତା ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରାଯାଇଥିଲା, ଯାହାକି ନିର୍ମାତାଙ୍କ ପ୍ରୋଟୋକଲ୍ ଅନୁଯାୟୀ ବ୍ରାଡଫୋର୍ଡ ଆସେ ବ୍ୟବହାର କରିଥିଲା |ଶୁଦ୍ଧତା SDS polyacrylamide (4–20%) ଜେଲ୍ ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋଫୋରେସିସ୍ ଏବଂ କୁମାସି ଉଜ୍ଜ୍ୱଳ ନୀଳ ଦାଗ ଦ୍ୱାରା ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରାଯାଇଥିଲା |20 ମିନିଟ୍ ଚକ୍ରରେ 10 kDa ମଲିକୁଲାର ଓଜନ କଟଅଫ୍ ସହିତ 4000 xg ରେ ସେଣ୍ଟ୍ରିଫୁଗ୍ ଫିଲ୍ଟର୍ (VivaSpin 20, GE Healthcare) ବ୍ୟବହାର କରି ପ୍ରୋଟିନ୍ ଏକାଗ୍ର ହେଲା |
ପ୍ରୋଟିନ୍ ସଲ୍ୟୁସନ୍ ଫୋପାଡି ଦିଅନ୍ତୁ ଏବଂ 150 µl କୁ 1 ମିଲି ସ୍ୱଚ୍ଛ ସେପ୍ଟମ୍ ଭିଆଲ୍ (8 x 40 mm ଥର୍ମୋ ସାଇଣ୍ଟିଫିକ୍) ରେ ସାବଧାନତାର ସହିତ ପାଇପ୍ କରନ୍ତୁ |ବାଷ୍ପୀକରଣକୁ ରୋକିବା ପାଇଁ ଟ୍ୟୁବ୍ ଗୁଡିକ ପାରାଫିଲ୍ମ ସହିତ ସିଲ୍ କରାଯାଇଥିଲା |ନମୁନାଗୁଡିକ (n = 3) 37 ° C କିମ୍ବା 60 ° C ରେ ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ଜେଲେସନ୍ ପାଳନ କରିବା ପାଇଁ ପର୍ଯ୍ୟାୟକ୍ରମେ ଓଲଟା କରାଯାଇଥିଲା |ଅନ୍ତତ least ପକ୍ଷେ ଏକ ସପ୍ତାହ ପାଇଁ ନମୁନାଗୁଡିକ ଜେଲ୍ ହୋଇନଥିଲା |10 µM ପ୍ରୋଟିନ୍ ପ୍ରତି 10MM DTT ସହିତ NTMiSp ଡିସଲଫାଇଡ୍ ବଣ୍ଡ ହ୍ରାସ କରନ୍ତୁ |ପ୍ରାକୃତିକ ସ୍ପାଇଡର ରେଶମ ଆବରଣର ଜେଲେସନକୁ ବିଶ୍ଳେଷଣ କରିବା ପାଇଁ ସ୍ Swedish ିଡେନ ବ୍ରିଜ ସ୍ପାଇଡର କଟିଗଲା, ଦୁଇଟି ମୁଖ୍ୟ ଆମ୍ପୁଲେଟେଡ୍ ଗ୍ରନ୍ଥିଗୁଡିକ 200 μl 20 mM Tris-HCl ବଫର୍ pH 8 ରେ ରଖାଗଲା ଏବଂ ଆବରଣକୁ ଗ୍ରନ୍ଥିରୁ ଅଲଗା ହେବାକୁ ଅନୁମତି ଦିଆଗଲା |।ଗ୍ରନ୍ଥିଗୁଡିକର ବିଷୟବସ୍ତୁ ବଫରରେ ଦ୍ରବୀଭୂତ ହୁଏ, ଶୁଖିଲା ଓଜନ ନିର୍ଣ୍ଣୟ ପାଇଁ 50 µl (60 ° C ରୁ ଖୋଲା ଭିଆଲ୍ ଇନକ୍ୟୁବେସନ ଦ୍ constant ାରା) ଏବଂ 37 ° C ରେ ଜେଲେସନ୍ ପାଇଁ 150 µl |
ମାପିବା ଜ୍ୟାମିତି / ସାଧନ ଷ୍ଟେନଲେସ୍ ଷ୍ଟିଲରେ ନିର୍ମିତ, ସମାନ୍ତରାଳ ପ୍ଲେଟ୍ ବ୍ୟବହାର କରି 20 ମିଲିମିଟର ଉପର ବ୍ୟାସ ଏବଂ 0.5 ମିଲିମିଟର ବ୍ୟବଧାନ |ଏକ ଷ୍ଟେନଲେସ୍ ଷ୍ଟିଲ୍ ତଳ ପେଲ୍ଟିଅର୍ ପ୍ଲେଟ୍ ବ୍ୟବହାର କରି ନମୁନାକୁ 25 ° C ରୁ 45 ° C ଏବଂ ପ୍ରତି ମିନିଟ୍ରେ 1 ° C ହାରରେ ଗରମ କରନ୍ତୁ |ସ୍ପନ୍ଦନ ମାପ 0.1 Hz ଫ୍ରିକ୍ୱେନ୍ସିରେ ଏବଂ ସାମଗ୍ରୀର ର line ଖ୍ୟ ଭିସକୋଲେଷ୍ଟିକ୍ ଅଞ୍ଚଳରେ ଯଥାକ୍ରମେ 100 ମିଗ୍ରା / ମିଏଲ ଏବଂ 300-500 ମିଗ୍ରା / ଏମଏଲ୍ ନମୁନା ପାଇଁ 5% ଏବଂ 0.5% ଷ୍ଟ୍ରେନ୍ରେ କରାଯାଇଥିଲା |ବାଷ୍ପୀକରଣକୁ ରୋକିବା ପାଇଁ ଏକ କଷ୍ଟମ୍ ଆର୍ଦ୍ରତା ଚାମ୍ବର ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ |ପ୍ରିଜିମ୍ using ବ୍ୟବହାର କରି ତଥ୍ୟ ବିଶ୍ଳେଷଣ କରାଯାଇଥିଲା |
ରୁମ ତାପମାତ୍ରାରେ 800 ରୁ 3900 ସେମି - 1 ରେ ଇନଫ୍ରାଡ୍ (IR) ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରା ସଂଗ୍ରହ ପାଇଁ |ପରୀକ୍ଷଣ ପୂର୍ବରୁ ଏବଂ ସମୟରେ ଶୁଖିଲା ଫିଲ୍ଟର ବାୟୁ ସହିତ ATR ଉପକରଣ, ଏବଂ ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରୋମିଟର ମାଧ୍ୟମରେ ଆଲୋକ ପଥକୁ ଶୁଦ୍ଧ କରାଯାଇଥାଏ |ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରାରେ ଜଳ ଅବଶୋଷଣ ଶିଖରକୁ କମ୍ କରିବା ପାଇଁ ସମାଧାନଗୁଡିକ (500 ମିଗ୍ରା / ମି.ଏଲ୍) ସ୍ଫଟିକ୍ ଉପରେ ପାଇପେଟ୍ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ମାପ ପୂର୍ବରୁ ଜେଲ୍ (500 ମିଗ୍ରା / ମିଏଲ୍) ଗଠନ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ପରେ ସ୍ଫଟିକକୁ ସ୍ଥାନାନ୍ତରିତ କରାଯାଇଥିଲା (n = 3) |2 ସେମି -1 ଏବଂ ଶୂନ ଡ୍ୟୁଟି ଚକ୍ରର ରିଜୋଲ୍ୟୁସନ୍ ସହିତ 1000 ସ୍କାନ୍ ରେକର୍ଡ କରାଯାଇଥିଲା |ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରା 1720 ରୁ 1580 ସେମି -1 ମଧ୍ୟରେ ସମାନ ଏକୀକରଣ ଅଞ୍ଚଳରେ ଏଫ୍ ମେଙ୍ଗେସ୍ “ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରାଗ୍ରିଫ୍ - ଅପ୍ଟିକାଲ୍ ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରସ୍କୋପି ସଫ୍ଟୱେର୍” ବ୍ୟବହାର କରି ସ୍ ized ାଭାବିକ ହୋଇଥିଲା।ATR-IR ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରସ୍କୋପିରେ, ଏକ ନମୁନାରେ ଇନଫ୍ରାଡ୍ ବିମ୍ ର ଅନୁପ୍ରବେଶ ଗଭୀରତା ତରଙ୍ଗ ଉପରେ ନିର୍ଭରଶୀଳ, ଫଳସ୍ୱରୂପ ଉଚ୍ଚ ତରଙ୍ଗ ଅପେକ୍ଷା କମ୍ ୱେଭେନ୍ମ୍ବରରେ ଅଧିକ ଶକ୍ତିଶାଳୀ ଅବଶୋଷଣ ହୁଏ |ଡିମ୍ବିରିରେ ଦେଖାଯାଇଥିବା ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରା ପାଇଁ ଏହି ପ୍ରଭାବଗୁଡିକ ସଂଶୋଧିତ ହୋଇନାହିଁ |3 କାରଣ ସେଗୁଡ଼ିକ ବହୁତ ଛୋଟ (ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 4) |ଏହି ଚିତ୍ର ପାଇଁ ସଂଶୋଧିତ ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରା ବ୍ରୁକର OPUS ସଫ୍ଟୱେର୍ ବ୍ୟବହାର କରି ଗଣନା କରାଯାଇଥିଲା |
ସାଧାରଣତ ,, I ଶିଖର ମଧ୍ୟରେ ଥିବା ଉପାଦାନଗୁଡ଼ିକର ନିର୍ଭରଯୋଗ୍ୟ ଡିକୋନଭୋଲ୍ୟୁସନ୍ ପରେ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଗଠନଗୁଡ଼ିକର ଏକ ବିସ୍ତୃତ ପରିମାଣ ସମ୍ଭବ |ତଥାପି, ଅଭ୍ୟାସରେ କିଛି ବାଧା ଉପୁଜେ |ଡେକନଭୋଲ୍ୟୁସନ୍ ସମୟରେ ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରମରେ ଶବ୍ଦ (ମିଥ୍ୟା) ଶିଖର ପରି ଦେଖାଯାଏ |ଏଥିସହ, ଜଳ ବଙ୍କା ହେତୁ ଶିଖର I amide ର ସ୍ଥିତି ସହିତ ମେଳ ଖାଏ ଏବଂ ବହୁ ପରିମାଣର ଜଳ ଧାରଣ କରିଥିବା ନମୁନା ପାଇଁ ସମାନ ପରିମାଣ ଥାଇପାରେ, ଯେପରିକି ଏଠାରେ ଅଧ୍ୟୟନ କରାଯାଇଥିବା ଜଳୀୟ ଜେଲ୍ |ତେଣୁ, ମୁଁ ଶିଖର ମଧ୍ୟରେ ଥିବା ଆମିଡ୍କୁ ସମ୍ପୂର୍ଣ୍ଣ ରୂପେ କ୍ଷୟ କରିବାକୁ ଚେଷ୍ଟା କରିନାହୁଁ, ଏବଂ ଆମର ପର୍ଯ୍ୟବେକ୍ଷଣଗୁଡିକ କେବଳ NMR ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରସ୍କୋପି ପରି ଅନ୍ୟ ପଦ୍ଧତିଗୁଡିକର ସମର୍ଥନରେ ବିଚାର କରାଯିବା ଉଚିତ୍ |
50 ମିଗ୍ରା / ମିଲି NT ଏବଂ His-NT2RepCT ର ସମାଧାନ 37 ° C ରେ ରାତାରାତି ଜେଲ୍ କରାଯାଇଥିଲା |ଏହା ପରେ ହାଇଡ୍ରୋଜେଲକୁ 20 ମିଟର ଟ୍ରାଇସ୍- HCl (pH 8) ସହିତ 12.5 ମିଗ୍ରା / ମିଲିର ଏକାଗ୍ରତା ସହିତ ମିଶ୍ରିତ କରାଯାଇଥିଲା, ଭଲ ଭାବରେ ହଲାଇ ଜେଲକୁ ଭାଙ୍ଗିବା ପାଇଁ ପାଇପ୍ କରାଯାଇଥିଲା |ପରବର୍ତ୍ତୀ ସମୟରେ, 20 ମିଟର ଟ୍ରାଇସ୍-ଏଚ୍ସିଏଲ୍ (pH 8) ସହିତ ହାଇଡ୍ରୋଜେଲ୍ 10 ଥର ମିଶ୍ରିତ ହେଲା, 5 μl ନମୁନା ଫର୍ମଭାର୍ ସହିତ ଆବୃତ ଏକ ତମ୍ବା ଗ୍ରୀଡ୍ ଉପରେ ପ୍ରୟୋଗ କରାଯାଇଥିଲା, ଏବଂ ଅତିରିକ୍ତ ନମୁନାକୁ ବ୍ଲୋଟିଂ ପେପର ସହିତ ବାହାର କରାଯାଇଥିଲା |ନମୁନାଗୁଡିକ 5 µl MilliQ ପାଣି ସହିତ ଦୁଇଥର ଧୋଇ ଦିଆଗଲା ଏବଂ 5 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ 1% ୟୁରାନିଲ୍ ଫର୍ମାଟ୍ ସହିତ ଦାଗ ଦିଆଗଲା |ଶୋଷକ କାଗଜ ସହିତ ଅତିରିକ୍ତ ଦାଗ କା ove ଼ିଦିଅ, ତାପରେ ଜାଲକୁ ଶୁଖାଇ ଦିଅ |100 କେଭିରେ କାର୍ଯ୍ୟ କରୁଥିବା FEI Tecnai 12 Spirit BioTWIN ବ୍ୟବହାର କରି ଏହି ଗ୍ରୀଡ୍ ଗୁଡିକରେ ଇମେଜିଙ୍ଗ୍ କରାଯାଇଥିଲା |ଭେଲେଟା 2k × 2k ସିସିଡି କ୍ୟାମେରା (ଅଲିମ୍ପସ୍ ସଫ୍ଟ ଇମେଜିଙ୍ଗ୍ ସଲ୍ୟୁସନ୍, ଜିଏମ୍ବିଏଚ୍, ମୁନ୍ଷ୍ଟର୍, ଜର୍ମାନୀ) ବ୍ୟବହାର କରି ପ୍ରତିଛବିଗୁଡିକ x 26,500 ଏବଂ x 43,000 ମ୍ୟାଗ୍ନିଫିକେସନ୍ ରେକର୍ଡ କରାଯାଇଥିଲା |ପ୍ରତ୍ୟେକ ନମୁନା ପାଇଁ (n = 1), 10-15 ପ୍ରତିଛବି ରେକର୍ଡ କରାଯାଇଥିଲା |ImageJ (https://imagej.nih.gov/) ପ୍ରତିଛବି ବିଶ୍ଳେଷଣ ଏବଂ ଫାଇବର ବ୍ୟାସ ମାପିବା ପାଇଁ ବ୍ୟବହୃତ ହୋଇଥିଲା (n = 100, ବିଭିନ୍ନ ତନ୍ତୁ) |ପ୍ରିଜିମ୍ 9 ଅବିଭକ୍ତ ଟି-ଟେଷ୍ଟ (ଦୁଇ-ଲାଞ୍ଜ) କରିବା ପାଇଁ ବ୍ୟବହୃତ ହୋଇଥିଲା |ତାଙ୍କର His-NT2RepCT ଏବଂ NT ଫାଇବ୍ରିଲ୍ ଯଥାକ୍ରମେ 11.43 (SD 2.035) ଏବଂ 7.67 (SD 1.389) nm ଥିଲା |ଆତ୍ମବିଶ୍ୱାସ ବ୍ୟବଧାନ (95%) ହେଉଛି -4.246 ରୁ -3.275 |ସ୍ freedom ାଧୀନତାର ଡିଗ୍ରୀ = 198, p <0.0001 |
10 µM ଥିଓଫ୍ଲାଭିନ୍ ଟି (ThT) ଧାରଣ କରିଥିବା 80 µl ତରଳ ନମୁନାଗୁଡିକ କର୍ନିଙ୍ଗ୍ 96-କୂଳ କଳା ତଳ ସ୍ୱଚ୍ଛ ତଳ ପ୍ଲେଟ୍ (କର୍ନିଙ୍ଗ ଗ୍ଲାସ୍ 3881, ଯୁକ୍ତରାଷ୍ଟ୍ର) ବ୍ୟବହାର କରି ଷ୍ଟାଟିକ୍ ଅବସ୍ଥାରେ ଟ୍ରିପ୍ଲିକେଟ୍ (n = 3) ରେ ମାପ କରାଯାଇଥିଲା |440 nm ଉତ୍ତେଜନା ଫିଲ୍ଟର ଏବଂ 480 nm ନିର୍ଗମନ ଫିଲ୍ଟର (ବିଏମଜି ଲାବଟେକ୍, ଅଫେନ୍ବର୍ଗ, ଜର୍ମାନୀରୁ FLUOStar ଗାଲାକ୍ସି) ବ୍ୟବହାର କରି ଫ୍ଲୋରୋସେନ୍ସ ପାର୍ଥକ୍ୟ ରେକର୍ଡ କରାଯାଇଥିଲା |ThT ସଙ୍କେତର ତୀବ୍ରତା ପରିବର୍ତ୍ତନ ନକରି ThT ର ବିଭିନ୍ନ ଏକାଗ୍ରତା ସହିତ ପରୀକ୍ଷଣ କରାଯାଇଥିବାରୁ ThT ସିଗନାଲ୍ ନା ସନ୍ତୁଳିତ କିମ୍ବା ଲିଭାଯାଇ ନଥିଲା |କୁହୁଡି ମାପ ପାଇଁ 360 nm ରେ ଅବଶୋଷଣ ରେକର୍ଡ କରନ୍ତୁ |ବିହନ ପରୀକ୍ଷଣ ପାଇଁ, 100 ମିଗ୍ରା / ମିଏଲ ଜେଲ 37 ° C ରେ ସୃଷ୍ଟି ହୋଇଥିଲା, ପୁନ us ସ୍ଥାପିତ ହୋଇଥିଲା ଏବଂ 5%, 10%, ଏବଂ 20% ମୋଲାର ଅନୁପାତରେ ବିହନ ପାଇଁ ବ୍ୟବହୃତ ହୋଇଥିଲା |ପ୍ରିଜିମ୍ using ବ୍ୟବହାର କରି ତଥ୍ୟ ବିଶ୍ଳେଷଣ କରାଯାଇଥିଲା |
His-NT2RepCT ଏବଂ NT> 100 mg / mL ବରଫ ଉପରେ ଥକ୍ ଷ୍ଟକ୍ ଏବଂ 0.22 µm ଫିଲ୍ଟର୍ ମାଧ୍ୟମରେ ଫିଲ୍ଟର୍ |ନାନୋଡ୍ରପ୍ ବ୍ୟବହାର କରି 280 nm ରେ ଅବଶୋଷଣ ମାପ କରି ଏକାଗ୍ରତା ଗଣନା କରାଯାଇଥିଲା |ଏକ ସ୍ୱଚ୍ଛ ତଳ ସହିତ 96-କୂଅ କଳା ଅଣ-ବାନ୍ଧୁଥିବା ପ୍ଲେଟ୍ (କର୍ନିଙ୍ଗ୍) ର କୂଅରେ, ନମୁନାଗୁଡିକ 20 ମିଗ୍ରା ଟ୍ରାଇସ୍- HCl pH 8 ରେ 20 ମିଗ୍ରା / ମିଲିରେ ମିଶ୍ରିତ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ 5 μM ThT (ଅନ୍ତିମ ଏକାଗ୍ରତା), ମୋଟ ନମୁନା ଏକାଗ୍ରତା ସହିତ ମିଶ୍ରିତ କରାଯାଇଥିଲା | 50 μl ଭଲ୍ୟୁମ୍ପ୍ରତି 10 ମିନିଟରେ 37 ° C ରେ ନମୁନାଗୁଡିକ ଏକ ସେଲ୍ ଓବସର୍ଭର (ଜିସ୍) ମାଇକ୍ରୋସ୍କୋପ୍ ଉପରେ ପ୍ରସାରିତ ଲାଇଟ୍ ଚ୍ୟାନେଲ୍ ଏବଂ ThT ଇମେଜିଙ୍ଗ୍ ପାଇଁ FITC ଉତ୍ତେଜନା ଏବଂ ନିର୍ଗମନ ଫିଲ୍ଟର ସେଟ୍ ସହିତ ଇମେଜ୍ କରାଯାଇଥିଲା |ଇମେଜିଙ୍ଗ୍ ପାଇଁ ଏକ 20x / 0.4 ଲେନ୍ସ ବ୍ୟବହୃତ ହୁଏ |ପ୍ରତିଛବି ବିଶ୍ଳେଷଣ ପାଇଁ ଜେନ୍ ବ୍ଲୁ (ଜିସ୍) ଏବଂ ଇମେଜ୍ (https://imagej.nih.gov/) ବ୍ୟବହୃତ ହୋଇଥିଲା |20 ମିଲ୍ ଟ୍ରାଇସ୍ pH 8 ଏବଂ 5 µM ThT ଧାରଣ କରିଥିବା 50 ମିଗ୍ରା / ମିଏଲ୍ର ଏକାଗ୍ରତାରେ NT ଏବଂ His-NT2RepCT ସମାଧାନରୁ ଗେଲଗୁଡିକ ମଧ୍ୟ ପ୍ରସ୍ତୁତ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ 90 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ 37 ° C ରେ ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତ କରାଯାଇଥିଲା |ଜେଲ୍ ଖଣ୍ଡଗୁଡିକ ଏକ ନୂତନ କୂଅକୁ 20 ମିଟର ଟ୍ରାଇସ୍, pH 8, ଏବଂ 5 μM ThT ଧାରଣ କରିଥିବା ଏକ ଅଣ-ବାନ୍ଧୁଥିବା କଳା 96 ଭଲ ସଫା ତଳ ପ୍ଲେଟରେ ସ୍ଥାନାନ୍ତରିତ କରାଯାଇଥିଲା |20x / 0.4 ବୃଦ୍ଧିରେ ସବୁଜ ଫ୍ଲୋରୋସେନ୍ସ ଏବଂ ଉଜ୍ଜ୍ୱଳ କ୍ଷେତ୍ର ପ୍ରତିଛବି ପ୍ରାପ୍ତ କରନ୍ତୁ |ପ୍ରତିଛବି ବିଶ୍ଳେଷଣ ପାଇଁ ImageJ ବ୍ୟବହୃତ ହୋଇଥିଲା |
ଏକ QCI ଚତୁର୍ଭୁଜ ରେଜୋନାନ୍ସ ପଲ୍ସଡ୍ ଗ୍ରେଡିଏଣ୍ଟ୍ ଫିଲ୍ଡ କ୍ରିପ୍ରୋବ୍ (HFCN) ସହିତ ସଜ୍ଜିତ 600 MHz ବ୍ରୁକର୍ ଆଭାନ୍ସ ନେଓ ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରୋମିଟରରେ ସମାଧାନ NMR ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରା 310 K ରେ ମିଳିଥିଲା |13C, 15N ସହିତ ଲେବଲ୍ ହୋଇଥିବା 10 ମିଗ୍ରା / ମିଏଲ୍ ସମଲିଙ୍ଗୀ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଧାରଣ କରିଥିବା NMR ନମୁନା, 20 ମିଟର ଟ୍ରାଇସ୍-ଏଚ୍ (pH 8), 0.02% (w / v) NaN3, 5% DO (v / v), (n = 1) ରେ ଦ୍ରବୀଭୂତ | ।PH 6.7 ରେ NT2RepCT ର ରାସାୟନିକ ପରିବର୍ତ୍ତନଗୁଡ଼ିକ 15N-HSQC ର 2D ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରମରେ ଶିଖର 23 ନ୍ୟସ୍ତ କରିବାକୁ ବ୍ୟବହୃତ ହୋଇଥିଲା |
ମ୍ୟାଜିକ୍ ଆଙ୍ଗଲ୍ ସ୍ପିନ୍ କଠିନ NMR (MAS) ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରା 13C, 15N- ଲେବଲ୍ ହାଇଡ୍ରୋଜେଲଗୁଡିକ ବ୍ରୁକର ଆଭାନ୍ସ III HD ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରୋମିଟରରେ 800 MHz ରେ 3.2 mm 13C / 15N {1H} ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋନଲେସ୍ ପ୍ରୋବ ସହିତ ରେକର୍ଡ କରାଯାଇଥିଲା |277 କେ ରେ ଏକ ପରିବର୍ତ୍ତନଶୀଳ ତାପମାତ୍ରା ଗ୍ୟାସ୍ ଷ୍ଟ୍ରିମ୍ ବ୍ୟବହାର କରି ନମୁନା ତାପମାତ୍ରାକୁ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ କରାଯାଇଥିଲା |1H ରୁ 13C ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ କ୍ରସ୍ ପୋଲାରାଇଜେସନ୍ (CP) 60H ରୁ 48.0 kHz 1H ରେ, 61.3 / 71.6 kHz 13C (12.5 / 20 kHz MAS ରେ) ଏବଂ ଯୋଗାଯୋଗ ସମୟ 0.5-1 ମି।ତଥ୍ୟ ସଂଗ୍ରହ ସମୟରେ 73.5 kHz ରେ ମେରୁଦଣ୍ଡ 6478 ଡିକୋପିଂ ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇଥିଲା |ଅଧିଗ୍ରହଣ ସମୟ 10 ମିଲିସେକେଣ୍ଡ ଏବଂ ଚକ୍ର ବିଳମ୍ବ 2.5 ସେକେଣ୍ଡ ଥିଲା |RFDR ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରାରେ ଦେଖାଯାଇଥିବା ଏକକ-ସଂଯୁକ୍ତ Cα / Cβ ସମ୍ପର୍କଗୁଡିକ ଚରିତ୍ରଗତ ଅବଶିଷ୍ଟ ପ୍ରକାରର ରାସାୟନିକ ଶିଫ୍ଟ ଏବଂ DARR ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରାରେ ବହୁଗୁଣିତ-ସଂଯୁକ୍ତ ସମ୍ପର୍କ ଉପରେ ଆଧାର କରି ନ୍ୟସ୍ତ କରାଯାଇଥିଲା |
Zipper79 ଡାଟାବେସ୍ (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) NT, NTFlSp, ଏବଂ NTMiSp ପାଇଁ ଫ୍ଲୁଟର ପ୍ରବୃତ୍ତି ଏବଂ ରୋଜେଟା ଶକ୍ତିର ମୂଲ୍ୟାଙ୍କନ ପାଇଁ ବ୍ୟବହୃତ ହୋଇଥିଲା |ଜିପର୍ ଡାଟାବେସ୍ ରୋଜେଟା ଏନର୍ଜି 80 କୁ ଗଣନା କରେ, ଯାହା ପ୍ରୋଟିନ୍ ଗଠନକୁ ମଡେଲ ଏବଂ ବିଶ୍ଳେଷଣ କରିବା ପାଇଁ ଅନେକ ମାଗଣା ଶକ୍ତି କାର୍ଯ୍ୟକୁ ଏକତ୍ର କରିଥାଏ |-23 kcal / mol କିମ୍ବା ତଳର ଏକ ଶକ୍ତି ସ୍ତର ଫାଇବ୍ରିଲେଟ୍ ପାଇଁ ଏକ ଉଚ୍ଚ ପ୍ରବୃତ୍ତିକୁ ସୂଚିତ କରେ |ନିମ୍ନ ଶକ୍ତିର ଅର୍ଥ ହେଉଛି ଜିପର୍ ରୂପାନ୍ତରଣରେ ଦୁଇଟି β- ଷ୍ଟ୍ରାଣ୍ଡର ଅଧିକ ସ୍ଥିରତା |ଏହା ସହିତ, ୱାଲ୍ଟଜ୍ ଆଲଗୋରିଦମ NT, NTFlSp ଏବଂ NTMiSp Ref ରେ ଆମିଲଏଡୋଜେନିକ୍ ଅଞ୍ଚଳଗୁଡିକର ପୂର୍ବାନୁମାନ କରିବାକୁ ବ୍ୟବହୃତ ହୋଇଥିଲା |81. (https://waltz.switchlab.org/) |
PH ପ୍ରୋଟିନ୍ ସମାଧାନ ଯଥାକ୍ରମେ pH 5.5 ଏବଂ 6.0 ରେ pH କୁ ହ୍ରାସ କରିବା ପାଇଁ 2- (N-morpholino) ଇଥାନେସୁଲଫୋନିକ୍ ଏସିଡ୍ (MES) ବଫର୍ ସହିତ ମିଶ୍ରିତ ହୋଇଥିଲା |ଅନ୍ତିମ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଏକାଗ୍ରତା 100 ମିଗ୍ରା / ମିଲି ଥିଲା |
0.1 ସେ.ମି.20 ମିଟର ଫସଫେଟ୍ ବଫର୍ (pH 8) ରେ ପ୍ରୋଟିନ୍ 10 μM (n = 1) ରେ ମିଶ୍ରିତ ହେଲା |ଲୁଣର ଉପସ୍ଥିତିରେ ପ୍ରୋଟିନ୍ ସ୍ଥିରତାକୁ ବିଶ୍ଳେଷଣ କରିବା ପାଇଁ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଗୁଡିକ ସମାନ ଏକାଗ୍ରତା (n = 1) ରେ 20 ମିଟର ଫସଫେଟ୍ ବଫର୍ (pH 8) ରେ ଯଥାକ୍ରମେ 154 ମିଟର NaF କିମ୍ବା NaCl ଧାରଣ କରାଯାଇଥିଲା |222 nm ରେ 25 ° C ରୁ 95 ° C ରେ ତାପମାତ୍ରା ସ୍କାନ୍ ରେକର୍ଡ କରାଯାଇଥିଲା ଯାହାକି 1 ° C / ମିନିଟ୍ ଗରମ ହାର ସହିତ |ଦେଶୀ ଫୋଲ୍ଡେଡ୍ ପ୍ରୋଟିନଗୁଡିକର ଅନୁପାତ ସୂତ୍ର (KDmeasure - KDfinal) / (KDstart - KDfinal) ବ୍ୟବହାର କରି ଗଣନା କରାଯାଇଥିଲା |ଏଥିସହ, ପ୍ରତ୍ୟେକ ନମୁନା ପାଇଁ 260 nm ରୁ 190 nm 25 ° C ରେ ଏବଂ 95 ° C ଗରମ ହେବା ପରେ ପାଞ୍ଚଟି ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରା ରେକର୍ଡ କରାଯାଇଥିଲା |ପାଞ୍ଚଟି ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରା ହାରାହାରି, ସଫାସୁତୁରା ହୋଇ ମୋଲାର ଏଲିପଟିସିଟିରେ ରୂପାନ୍ତରିତ ହେଲା |ପ୍ରିଜିମ୍ using ବ୍ୟବହାର କରି ତଥ୍ୟ ବିଶ୍ଳେଷଣ କରାଯାଇଥିଲା |
His-NT-GFP (300 mg / mL, 80 µL) ର ଫ୍ଲୋରୋସେନ୍ସ ତୀବ୍ରତା ସ୍ଥିର ଅବସ୍ଥାରେ ଏକ କଳା ସ୍ୱଚ୍ଛ ତଳ (କର୍ନିଙ୍ଗ ଗ୍ଲାସ୍ 3881, ଯୁକ୍ତରାଷ୍ଟ୍ର) ସହିତ 96-କୂଅ କର୍ନିଙ୍ଗ ପ୍ଲେଟରେ ଟ୍ରିପ୍ଲିକେଟ୍ (n = 3) ରେ ମାପ କରାଯାଇଥିଲା |395 nm ର ଉତ୍ତେଜନା ତରଙ୍ଗଦ eng ର୍ଘ୍ୟ ସହିତ ଫ୍ଲୋରୋସେନ୍ସ-ଆଧାରିତ ପ୍ଲେଟ୍ ରିଡର୍ ସହିତ ନମୁନା ମାପନ୍ତୁ ଏବଂ ନିର୍ଗମନକୁ 509 nm ରେ ଏବଂ 2 ଘଣ୍ଟା ପରେ 37 ° C ରେ ରେକର୍ଡ କରନ୍ତୁ |ପ୍ରିଜିମ୍ 9 ସହିତ ତଥ୍ୟ ବିଶ୍ଳେଷଣ କରାଯାଇଥିଲା |
ନିର୍ମାତାଙ୍କ ନିର୍ଦ୍ଦେଶ ଅନୁଯାୟୀ ପ୍ୟୁରିନ୍ ନ୍ୟୁକ୍ଲିଓସାଇଡ୍ ଫସଫୋରୀଲେଜ୍ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ଆସେ କିଟ୍ (ଫ୍ଲୋରୋମେଟ୍ରିକ୍ ପଦ୍ଧତି, ସିଗମା ଆଲଡ୍ରିଚ୍) ବ୍ୟବହୃତ ହୋଇଥିଲା |ଜେଲରେ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ମାପିବା ପାଇଁ ଏବଂ His-NT-PNP ଧାରଣ କରିଥିବା ସମାଧାନଗୁଡିକ, 10-ng His-NT-PNP କୁ 100 mg / mL NT ସହିତ ସମୁଦାୟ 2 µL ମିଶ୍ରଣ କରନ୍ତୁ କାରଣ ଜେଲ୍ ସେଟ୍ ର ଚିହ୍ନଟ ବ୍ୟବଧାନ ଉପରେ ଏକ ସଙ୍କେତ ଦେଇଛି |His-NT-PNP ବିନା ଜେଲ ଏବଂ ସମାଧାନ ପାଇଁ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ ଅନ୍ତର୍ଭୂକ୍ତ କରାଯାଇଥିଲା |ମାପ ଦୁଇଥର କରାଯାଇଥିଲା (n = 2) |କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ମାପିବା ପରେ, ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ମିଶ୍ରଣକୁ ହଟାଇ ଦିଆଗଲା ଏବଂ ମାପିବା ସମୟରେ ଜେଲ୍ ଅକ୍ଷୁର୍ଣ୍ଣ ରହିଲା କି ନାହିଁ ନିଶ୍ଚିତ କରିବାକୁ ଜେଲ୍ ଫଟୋଗ୍ରାଫ୍ ହେଲା |ପ୍ରିଜିମ୍ using ବ୍ୟବହାର କରି ତଥ୍ୟ ବିଶ୍ଳେଷଣ କରାଯାଇଥିଲା |
ଅଧ୍ୟୟନ ଡିଜାଇନ୍ ବିଷୟରେ ଅଧିକ ସୂଚନା ପାଇଁ, ଏହି ଆର୍ଟିକିଲ୍ ସହିତ ଲିଙ୍କ୍ ହୋଇଥିବା ପ୍ରକୃତି ଅଧ୍ୟୟନର ଅବକ୍ଷୟ ଦେଖନ୍ତୁ |
ଚିତ୍ର 1 ଏବଂ 2 ପ୍ରାରମ୍ଭିକ ତଥ୍ୟ ଉପସ୍ଥାପନ କରେ |1c, 2a - c, 3a, b, e - g, 4, 5b, d, f, ଏବଂ 6, ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଡିମ୍ବିର୍ |3, ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଡିମ୍ବିର୍ |5a, d, ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଡିମ୍ବିରି |6 ଏବଂ ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଡିମ୍ବିର୍ |8. ଏହି ଅଧ୍ୟୟନରୁ ତଥ୍ୟ ତଥ୍ୟ ଜେନୋଡୋ ଡାଟାବେସରେ https://doi.org/10.5281/zenodo.6683653 ରେ ହୋଷ୍ଟ କରାଯାଇଛି |ଏହି ଅଧ୍ୟୟନରେ ପ୍ରାପ୍ତ NMR ତଥ୍ୟ BMRBig ରେପୋଜିଟୋରୀରେ ପ୍ରବେଶ ID bmrbig36 ଅଧୀନରେ ପୋଷ୍ଟ କରାଯାଇଥିଲା |GFP ଏବଂ PNP ର ସଂରଚନା PDB (GFP 2B3Q, PNP 4RJ2) ରୁ ନିଆଯାଇଥିଲା |
ରାଇଜିଂ, ଏ ଏବଂ ଜୋହାନ୍ସନ୍, ଜେ।ଜାତୀୟ ରାସାୟନିକ |ଜୀବବିଜ୍ଞାନ |11, 309-315 (2015)
ବାବ୍, ପିଏଲ୍ ଏବଂ ଅନ୍ୟମାନେ |ନେଫିଲା କ୍ଲାଭାଇପ୍ସ ଜିନୋମ ସ୍ପାଇଡର ରେଶମ ଜିନ୍ ର ବିବିଧତା ଏବଂ ସେମାନଙ୍କର ଜଟିଳ ଅଭିବ୍ୟକ୍ତିକୁ ଆଲୋକିତ କରେ |ଜାତୀୟ ଜେନେଟ୍ |49, 895–903 (2017) |
ପୋଷ୍ଟ ସମୟ: ମାର୍ଚ -12-2023 |