347 12.7 * 1.24 ମିମି ଷ୍ଟେନଲେସ୍ ଷ୍ଟିଲ୍ କୋଇଲ୍ ଟ୍ୟୁବ୍, ସିଙ୍କ୍ରୋନସ୍ ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋଷ୍ଟାଟିକ୍ କଣ୍ଡେନ୍ସେସନର ମଲିକୁଲାର ମେକାନିଜିମ୍ ଏବଂ α- ସିନୁକଲିନ୍ ଏବଂ ଟାଉର ଏକତ୍ରିକରଣ |

Nature.com ପରିଦର୍ଶନ କରିଥିବାରୁ ଧନ୍ୟବାଦ |ସୀମିତ CSS ସମର୍ଥନ ସହିତ ଆପଣ ଏକ ବ୍ରାଉଜର୍ ସଂସ୍କରଣ ବ୍ୟବହାର କରୁଛନ୍ତି |ସର୍ବୋତ୍ତମ ଅଭିଜ୍ଞତା ପାଇଁ, ଆମେ ପରାମର୍ଶ ଦେଉଛୁ ଯେ ଆପଣ ଏକ ଅପଡେଟ୍ ବ୍ରାଉଜର୍ ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ (କିମ୍ବା ଇଣ୍ଟରନେଟ୍ ଏକ୍ସପ୍ଲୋରରରେ ସୁସଙ୍ଗତତା ମୋଡ୍ ଅକ୍ଷମ କରନ୍ତୁ) |ଏହା ସହିତ, ଚାଲୁଥିବା ସମର୍ଥନ ନିଶ୍ଚିତ କରିବାକୁ, ଆମେ ଶ yles ଳୀ ଏବଂ ଜାଭାସ୍କ୍ରିପ୍ଟ ବିନା ସାଇଟ୍ ଦେଖାଇଥାଉ |
ସ୍ଲାଇଡ୍ ପ୍ରତି ସ୍ଲାଇଡ୍ ତିନୋଟି ଆର୍ଟିକିଲ୍ ଦେଖାଉଛି |ପ୍ରତ୍ୟେକ ସ୍ଲାଇଡ୍ ଦେଇ ଗତି କରିବା ପାଇଁ ସ୍ଲାଇଡ୍ କିମ୍ବା ଶେଷରେ ସ୍ଲାଇଡ୍ କଣ୍ଟ୍ରୋଲର୍ ବଟନ୍ ବ୍ୟବହାର କରିବାକୁ ପଛ ଏବଂ ପରବର୍ତ୍ତୀ ବଟନ୍ ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ |

347 ଷ୍ଟେନଲେସ୍ ଷ୍ଟିଲ୍ ପାଇପ୍ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟକରଣ |

347 12.7 * 1.24 ମିମି ଷ୍ଟେନଲେସ୍ ଷ୍ଟିଲ୍ କୋଇଲ୍ ଟ୍ୟୁବ୍ |

ବାହାରେ ବ୍ୟାସ: 6.00 mm OD ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ 914.4 mm OD, ଆକାର 24 ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ NB ଉପଲବ୍ଧ ଏକ୍ସ-ଷ୍ଟକ୍, OD ସାଇଜ୍ ଷ୍ଟିଲ୍ ଟ୍ୟୁବ୍ ଉପଲବ୍ଧ ଏକ୍ସ-ଷ୍ଟକ୍ |

SS 347 ପାଇପ୍ ମୋଟା ପରିସର: 0.3 ମିମି - 50 ମିମି, SCH 5, SCH10, SCH 40, SCH 80, SCH 80S, SCH 160, SCH XXS, SCH XS
WT: SCH5S, SCH10S, SCH40S, SCH80S, SCH160S, ଇତ୍ୟାଦି (0.5-12 ମିମି) କିମ୍ବା ଆବଶ୍ୟକତା ଅନୁଯାୟୀ ସଜାଇବାକୁ ଅଣ-ନିୟମିତ ଆକାର |

ପ୍ରକାର: SS 347 ବିହୀନ ପାଇପ୍ | |SS 347 ERW ପାଇପ୍ |SS 347 ୱେଲଡେଡ୍ ପାଇପ୍ |SS 347 କପଡା ପାଇପ୍ |SS 347 CDW ଟ୍ୟୁବ୍, LSAW ପାଇପ୍ / ସିମ୍-ୱେଲଡେଡ୍ / ପୁନ Red ଚିତ୍ରିତ |

ଫର୍ମ: SS 347 ରାଉଣ୍ଡ ପାଇପ୍ / ଟ୍ୟୁବ୍, SS 347 ସ୍କୋୟାର୍ ପାଇପ୍ / ଟ୍ୟୁବ୍, SS 347 ଆୟତାକାର ପାଇପ୍ / ଟ୍ୟୁବ୍, SS 347 କୋଇଲ୍ଡ ଟ୍ୟୁବ୍, SS 347 “U” ଆକୃତି, SS 347 ପ୍ୟାନ୍ କେକ୍ କୋଇଲ୍, SS 347 ହାଇଡ୍ରୋଲିକ୍ ଟ୍ୟୁବ୍ |

ଦ Length ର୍ଘ୍ୟ: ଏକକ ରାଣ୍ଡମ, ଡବଲ୍ ରାଣ୍ଡମ ଏବଂ ଆବଶ୍ୟକ ଦ Length ର୍ଘ୍ୟ ଶେଷ: ସାଧା ଏଣ୍ଡ, ବେଭେଲଡ୍ ଏଣ୍ଡ, ଟ୍ରେଡ୍ |

ଶେଷ ସୁରକ୍ଷା: ପ୍ଲାଷ୍ଟିକ୍ କ୍ୟାପ୍ |ବାହାରେ ସମାପ୍ତ: 2B, No.4, No.1, No.8 ଷ୍ଟେନଲେସ୍ ଷ୍ଟିଲ୍ ପାଇପ୍ ପାଇଁ ଦର୍ପଣ ସମାପ୍ତ, ଗ୍ରାହକଙ୍କ ଆବଶ୍ୟକତା ଅନୁଯାୟୀ ସମାପ୍ତ କରନ୍ତୁ |

ବିତରଣ ଅବସ୍ଥା: ଆନ୍ନାଲେଡ୍ ଏବଂ ପିକଲେଡ୍, ପଲିସ୍, ଉଜ୍ଜ୍ୱଳ ଆନ୍ନାଲେଡ୍, ଥଣ୍ଡା ଅଙ୍କିତ |

ଯାଞ୍ଚ, ପରୀକ୍ଷା ରିପୋର୍ଟ: ମିଲ୍ ପରୀକ୍ଷା ପ୍ରମାଣପତ୍ର, EN 10204 3.1, ରାସାୟନିକ ରିପୋର୍ଟ, ଯାନ୍ତ୍ରିକ ରିପୋର୍ଟ, PMI ପରୀକ୍ଷା ରିପୋର୍ଟ, ଭିଜୁଆଲ୍ ଇନ୍ସପେକ୍ଟର ରିପୋର୍ଟ, ତୃତୀୟ ପକ୍ଷ ଯାଞ୍ଚ ରିପୋର୍ଟ, NABL ଅନୁମୋଦିତ ଲ୍ୟାବ ରିପୋର୍ଟ, ବିନାଶକାରୀ ପରୀକ୍ଷା ରିପୋର୍ଟ, ବିନାଶକାରୀ ପରୀକ୍ଷା ରିପୋର୍ଟ |

ପ୍ୟାକିଂ: କାଠ ବାକ୍ସ, ପ୍ଲାଷ୍ଟିକ୍ ବ୍ୟାଗ୍, ଷ୍ଟିଲ୍ ଷ୍ଟ୍ରିପ୍ ବଣ୍ଡଲ୍, କିମ୍ବା ଗ୍ରାହକଙ୍କ ଅନୁରୋଧ ଅନୁଯାୟୀ ପ୍ୟାକ୍ ହୋଇଛି |

ବିଶେଷ: ଉପରୋକ୍ତ ବ୍ୟତୀତ ଆକାର ଏବଂ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟତା ଅନୁରୋଧ ଅନୁଯାୟୀ ପ୍ରସ୍ତୁତ କରାଯାଇପାରିବ |

SS 347 ପାଇପ୍ ସାଇଜ୍ ପରିସର: 1/2 ଇଞ୍ଚ NB, OD ରୁ 24 ଇଞ୍ଚ |

ASTM A312 347: ଉଚ୍ଚ ତାପମାତ୍ରା ଏବଂ ସାଧାରଣ କ୍ଷତିକାରକ ସେବା ପାଇଁ ଉଦ୍ଦିଷ୍ଟ ବିହୀନ ଏବଂ ସିଧା ସିଲ୍ ୱେଲଡେଡ୍ ଆଷ୍ଟେନେଟିକ୍ ପାଇପ୍ |ୱେଲଡିଂ ସମୟରେ ଫିଲର୍ ଧାତୁ ଅନୁମତିପ୍ରାପ୍ତ ନୁହେଁ |

ASTM A358 347: କ୍ଷତିକାରକ ଏବଂ / କିମ୍ବା ଉଚ୍ଚ ତାପମାତ୍ରା ସେବା ପାଇଁ ବ Electric ଦ୍ୟୁତିକ ଫ୍ୟୁଜନ୍ ଆଷ୍ଟେନେଟିକ୍ ପାଇପ୍ ୱେଲ୍ଡେଡ୍ |ସାଧାରଣତ only କେବଳ 8 ଇଞ୍ଚ ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ ପାଇପ୍ ଏହି ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟକରଣ ପାଇଁ ଉତ୍ପାଦିତ ହୁଏ |ୱେଲଡିଂ ସମୟରେ ଫିଲର ଧାତୁ ଯୋଗ କରିବାକୁ ଅନୁମତି ଦିଆଯାଇଛି |

ASTM A790 347: ସାଧାରଣ କ୍ଷତିକାରକ ସେବା ପାଇଁ ଉଦ୍ଦିଷ୍ଟ ସିମ୍ଲେସ୍ ଏବଂ ସିଧା-ସିଲ୍ ୱେଲଡେଡ୍ ଫେରିଟିକ୍ / ଆଷ୍ଟେନେଟିକ୍ (ଡୁପ୍ଲେକ୍ସ) ପାଇପ୍, ଚାପର କ୍ଷୟ କ୍ରାକର ପ୍ରତିରୋଧ ଉପରେ ଏକ ବିଶେଷ ଗୁରୁତ୍ୱ ଦିଆଯାଉଛି |

ASTM A409 34.

ASTM A376 347: ଉଚ୍ଚ ତାପମାତ୍ରା ପ୍ରୟୋଗ ପାଇଁ ବିହୀନ ଆଷ୍ଟେନେଟିକ୍ ପାଇପ୍ |

ASTM A813 347: ଉଚ୍ଚ ତାପମାତ୍ରା ଏବଂ ସାଧାରଣ କ୍ଷତିକାରକ ପ୍ରୟୋଗଗୁଡ଼ିକ ପାଇଁ ଏକକ-ସିମ୍, ଏକକ- କିମ୍ବା ଡବଲ୍-ୱେଲଡେଡ୍ ଆଷ୍ଟେନେଟିକ୍ ପାଇପ୍ |

ASTM A814 347: ଉଚ୍ଚ ତାପମାତ୍ରା ଏବଂ ସାଧାରଣ କ୍ଷତିକାରକ ସେବା ପାଇଁ ଶୀତଳ କାର୍ଯ୍ୟ କରୁଥିବା ୱେଲଡେଡ୍ ଆଷ୍ଟେନେଟିକ୍ ପାଇପ୍ |

347H ଷ୍ଟେନଲେସ୍ ଷ୍ଟିଲ୍ ପାଇପ୍ ରାସାୟନିକ ରଚନା |

ଷ୍ଟେନଲେସ୍ ଷ୍ଟିଲ୍ 347H ପାଇପ୍ ମେକାନିକାଲ୍ ଗୁଣ |

ଷ୍ଟେନଲେସ୍ ଷ୍ଟିଲ୍ 347H ପାଇପ୍ ଭ Phys ତିକ ଗୁଣ |

347H ଷ୍ଟେନଲେସ୍ ଷ୍ଟିଲ୍ ପାଇପ୍ ପାଇଁ ସମାନ ଗ୍ରେଡ୍ |

ଆମିଲଏଡ୍ ଆଲଫା-ସିନୁକ୍ଲିନ୍ (αS) ଏକୀକରଣ ହେଉଛି ପାର୍କିନ୍ସନ୍ ରୋଗ ଏବଂ ଅନ୍ୟାନ୍ୟ ସିନୁକ୍ଲିନୋପାଥିର ଏକ ଚିହ୍ନ |ସମ୍ପ୍ରତି, ଅଲଜାଇମର ରୋଗ ସହିତ ଜଡିତ ଟାଉ ପ୍ରୋଟିନ୍ αS ପାଥୋଲୋଜି ସହିତ ଜଡିତ ହୋଇଛି ଏବଂ αS ସମୃଦ୍ଧ ଅନ୍ତର୍ଭୂକ୍ତିରେ ସହ-ଲୋକାଲାଇଜ୍ ହୋଇଥିବା ଜଣାପଡିଛି, ଯଦିଓ ଦୁଇଟି ପ୍ରୋଟିନର ଏକତ୍ରିକରଣର ମଲିକୁଲାର ପ୍ରଣାଳୀ ଅସ୍ପଷ୍ଟ ରହିଛି |ଆମେ ଏଠାରେ ରିପୋର୍ଟ କରୁଛୁ ଯେ phaseS ପର୍ଯ୍ୟାୟ ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋଷ୍ଟାଟିକ୍ କମ୍ପ୍ଲେକ୍ସ କଣ୍ଡେନ୍ସେସନ ମାଧ୍ୟମରେ ତରଳ କଣ୍ଡେନ୍ସେଟରେ ପୃଥକ ହୁଏ ଯେପରି ଟାଉ ଭଳି ସକରାତ୍ମକ ଚାର୍ଜ ହୋଇଥିବା ପଲିପେପ୍ଟାଇଡ୍ ସହିତ |ପଲିକେସନ୍ ପାଇଁ αS ର ସମ୍ବନ୍ଧ ଏବଂ କୋଏଗୁଲେସନ୍ ନେଟୱାର୍କର ଭାଲେନ୍ସ ହ୍ରାସର ହାର ଉପରେ ନିର୍ଭର କରି, କ୍ଲଟ୍ ଗୁଡିକ ଦ୍ରୁତ ଜେଲେସନ୍ କିମ୍ବା କୋଏଲେସେନ୍ସ ଦେଇଥାଏ ଏବଂ ପରେ ଧୀର ଆମିଲଏଡ୍ ଏଗ୍ରିଗେସନ୍ |ଉନ୍ନତ ବାୟୋଫିଜିକାଲ୍ କ ques ଶଳର ଏକ ସୁଟ୍ ମିଶ୍ରଣ କରି, ଆମେ ତରଳ-ତରଳ αS / Tau ପର୍ଯ୍ୟାୟ ପୃଥକତାକୁ ବର୍ଣ୍ଣିତ କରିବାରେ ସକ୍ଷମ ହୋଇଥିଲୁ ଏବଂ ଏକ ମୁଖ୍ୟ ପ୍ରୋଟିନ୍ କଣ୍ଡେନ୍ସେଟରେ ଉଭୟ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଧାରଣ କରିଥିବା ହେଟେରୋଜିନସ୍ ଏଗ୍ରିଗେଟ୍ ଗଠନ ପାଇଁ ମୁଖ୍ୟ କାରଣଗୁଡିକ ଚିହ୍ନଟ କରିଥିଲୁ |
ମେମ୍ବ୍ରେନ୍ କମ୍ପାର୍ଟମେଣ୍ଟ୍ ସହିତ, କୋଷଗୁଡ଼ିକରେ ସ୍ଥାନିକ ପୃଥକତା ମଧ୍ୟ ପ୍ରୋଟିନ୍-ସମୃଦ୍ଧ, ବାୟୋମୋଲେକୁଲାର୍ କଣ୍ଡେନ୍ସେଟ୍ କିମ୍ବା ବୁନ୍ଦା ନାମକ ତରଳ-ଘନ ଶରୀର ଗଠନ ଦ୍ୱାରା ତରଳ-ତରଳ ପର୍ଯ୍ୟାୟ ପୃଥକତା (LLPS) ଭାବରେ ଜଣାଶୁଣା ପ୍ରକ୍ରିୟା ଦ୍ୱାରା ହାସଲ କରାଯାଇପାରେ |ଏହି ବୁନ୍ଦା ବହୁବିଧ ସାମୟିକ ପାରସ୍ପରିକ କ୍ରିୟା ଦ୍ formed ାରା ଗଠିତ ହୁଏ, ସାଧାରଣତ prot ପ୍ରୋଟିନ୍ କିମ୍ବା ପ୍ରୋଟିନ୍ ଏବଂ RNA ମଧ୍ୟରେ, ଏବଂ ପ୍ରାୟ ସମସ୍ତ ଜୀବ ପ୍ରଣାଳୀରେ ବିଭିନ୍ନ କାର୍ଯ୍ୟ କରିଥାଏ |ବହୁ ସଂଖ୍ୟକ LLP- ସକ୍ଷମ ପ୍ରୋଟିନ୍ ନିମ୍ନ ଜଟିଳତାର କ୍ରମ ପ୍ରଦର୍ଶନ କରେ ଯାହା ପ୍ରକୃତି ଏବଂ ବାୟୋମୋଲ୍ୟୁକୁଲାର କଣ୍ଡେନ୍ସେଟ୍ ଗଠନରେ ଅତ୍ୟଧିକ ବିକୃତ |ଅନେକ ପରୀକ୍ଷାମୂଳକ ଅଧ୍ୟୟନ ପ୍ରୋଟିନର ନମନୀୟ, ପ୍ରାୟତ dis ବିଶୃଙ୍ଖଳିତ ଏବଂ ବହୁମୁଖୀ ପ୍ରକୃତି ପ୍ରକାଶ କରିଛି ଯାହା ଏହି ତରଳ ପରି କଣ୍ଡେନ୍ସେଟ୍ ଗଠନ କରେ, ଯଦିଓ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ମଲିକୁଲାର ନିର୍ଣ୍ଣୟକାରୀ ବିଷୟରେ ଅଳ୍ପ ଜଣା, ଯାହା ଏହି କଣ୍ଡେନ୍ସର ବୃଦ୍ଧି ଏବଂ ପରିପକ୍ୱତାକୁ ଅଧିକ କଠିନ ପରି ନିୟନ୍ତ୍ରଣ କରେ | ରାଜ୍ୟ।
ନୂତନ ତଥ୍ୟ ଅନୁମାନକୁ ସମର୍ଥନ କରେ ଯେ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଚାଳିତ LLPS ଏବଂ ବୁନ୍ଦାକୁ କଠିନ ସଂରଚନାରେ ରୂପାନ୍ତର କରିବା ପ୍ରାସଙ୍ଗିକ ସେଲୁଲାର୍ ପଥ ହୋଇପାରେ ଯାହା ଅବିସ୍ମରଣୀୟ ବିଷାକ୍ତ ଏଗ୍ରିଗେଟ୍ ଗଠନ କରିଥାଏ ଯାହା ପ୍ରାୟତ de ଅବକ୍ଷୟ ରୋଗର ଚିହ୍ନ ଅଟେ |ଅନେକ LLPS- ଜଡିତ ଅନ୍ତର୍ନିହିତ ଭାବରେ ବିକୃତ ପ୍ରୋଟିନ୍ (IDP), ପ୍ରାୟତ highly ଅତ୍ୟଧିକ ଚାର୍ଜଯୁକ୍ତ ଏବଂ ନମନୀୟ, ଆମିଲଏଡ୍ ଏଗ୍ରିଗେସନ୍ ପ୍ରକ୍ରିୟା ମାଧ୍ୟମରେ ନ୍ୟୁରୋଡେଜେନେରେସନ୍ ସହିତ ଜଡିତ |ବିଶେଷ ଭାବରେ, ବାୟୋମୋଲ୍ୟୁକୁଲାର୍ IDP କଣ୍ଡେନ୍ସେଟ୍ ଯେପରିକି FUS7 କିମ୍ବା TDP-438 କିମ୍ବା ବୃହତ ନିମ୍ନ ଜଟିଳତା ଡୋମେନ୍ ସହିତ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଯେପରିକି hnRNPA19 ଫ୍ଲୁଇଡାଇଜେସନ୍ ନାମକ ଏକ ପ୍ରକ୍ରିୟା ମାଧ୍ୟମରେ ଜେଲ୍ ପରି କିମ୍ବା କଠିନ ରୂପରେ ଦେଖାଯାଏ |ଯ ound ଗିକ |କଠିନ ପର୍ଯ୍ୟାୟ ପରିବର୍ତ୍ତନ (LSPT) କୁ ସମୟର କାର୍ଯ୍ୟ ଭାବରେ କିମ୍ବା ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ପରବର୍ତ୍ତୀ ଅନୁବାଦ ପରିବର୍ତ୍ତନ କିମ୍ବା ପାଥୋଲୋଜିକାଲ୍ ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ପରିବର୍ତ୍ତନଗୁଡ଼ିକର ପ୍ରତିକ୍ରିୟାରେ |
ଭିଭୋରେ LLPS ସହିତ ଜଡିତ ଅନ୍ୟ ଏକ IDP ହେଉଛି ଟାଉ, ଏକ ମାଇକ୍ରୋଟ୍ୟୁବୁଲ୍-ଜଡିତ ବିକୃତ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଯାହାର ଆମ୍ଲୋଏଡ୍ ଏଗ୍ରିଗେସନ୍ ଆଲଜାଇମର ରୋଗରେ ଜଡିତ ଥିଲା କିନ୍ତୁ ପାର୍କିନ୍ସନ୍ ରୋଗ (PD) ଏବଂ ଅନ୍ୟାନ୍ୟ ସିନେପ୍ଟିକ୍ ଆଣବିକ ପ୍ରୋଟିନୋପାଥି 11, 12, 13 ସହିତ ଜଡିତ |ଅନୁକୂଳ ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋଷ୍ଟାଟିକ୍ ପାରସ୍ପରିକ କ୍ରିୟା ହେତୁ ଟାଉ ସ୍ solution ତ ane ସ୍ପୃତ ଭାବରେ ସମାଧାନ / ସାଇଟୋପ୍ଲାଜମରୁ ବିଚ୍ଛିନ୍ନ ହୋଇଥିବାର ଦେଖାଯାଇଛି, ଫଳସ୍ୱରୂପ ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋ-ଷ୍ଟାଟିକ୍ କୋଏକର୍ଭେଟ୍ ଭାବରେ ଜଣାଶୁଣା ଟାଉ-ସମୃଦ୍ଧ ବୁନ୍ଦା ସୃଷ୍ଟି ହୁଏ |ଏହା ମଧ୍ୟ ଦେଖାଯାଇଛି ଯେ ଏହି ପ୍ରକାରର ଅଣ-ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ପାରସ୍ପରିକ କ୍ରିୟା ପ୍ରକୃତିର ଅନେକ ବାୟୋମୋଲ୍ୟୁକୁଲାର କଣ୍ଡେନ୍ସେଟଗୁଡିକର ଚାଳକ ଶକ୍ତି ଅଟେ |ଏକ ଟାଉ ପ୍ରୋଟିନ୍ କ୍ଷେତ୍ରରେ, ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋଷ୍ଟାଟିକ୍ ଏଗ୍ରିଗେସନ୍ ସରଳ ଏଗ୍ରିଗେସନ୍ ଦ୍ୱାରା ସୃଷ୍ଟି ହୋଇପାରେ, ଯେଉଁଥିରେ ପ୍ରୋଟିନର ବିପରୀତ ଚାର୍ଜ ହୋଇଥିବା ଅଞ୍ଚଳଗୁଡିକ କ୍ଲାଭେଜ୍ ପ୍ରକ୍ରିୟାକୁ ଟ୍ରିଗର କରିଥାଏ, କିମ୍ବା RNA ଭଳି ନକାରାତ୍ମକ ଚାର୍ଜଯୁକ୍ତ ପଲିମର ସହିତ ପାରସ୍ପରିକ କ୍ରିୟା ମାଧ୍ୟମରେ ଜଟିଳ ଏକୀକରଣ ଦ୍ୱାରା |
ସମ୍ପ୍ରତି, PD- ସିନୁକଲିନ୍ (αS), PD ଏବଂ ଅନ୍ୟାନ୍ୟ ନ୍ୟୁରୋଡେଜେନେରେଟିଭ୍ ରୋଗରେ ଜଡିତ ଏକ ଆମିଲଏଡ୍ IDP, ସିନ୍ୟୁକ୍ଲିନୋପାଥି 17,18 ଭାବରେ ଜଣାଶୁଣା, ସେଲୁଲାର୍ ଏବଂ ପଶୁ ମଡେଲରେ ପ୍ରଦର୍ଶିତ ହୋଇଛି 19,20 ତରଳ ପଦାର୍ଥ ଭଳି ପ୍ରୋଟିନ୍ କଣ୍ଡେନ୍ସେଟରେ ଏକାଗ୍ର |ଭିଟ୍ରୋ ଅଧ୍ୟୟନରୁ ଜଣାପଡିଛି ଯେ ମୁଖ୍ୟତ hyd ହାଇଡ୍ରୋଫୋବିକ୍ ପାରସ୍ପରିକ କ୍ରିୟା ମାଧ୍ୟମରେ simpleS ସରଳ ଏକୀକରଣ ଦ୍ୱାରା LLPS ଅତିକ୍ରମ କରେ, ଯଦିଓ ଏହି ପ୍ରକ୍ରିୟା ଅତ୍ୟଧିକ ଉଚ୍ଚ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଏକାଗ୍ରତା ଏବଂ ସାଧାରଣତ long ଲମ୍ବା ଇନକ୍ୟୁବେସନ ସମୟ 19,21 ଆବଶ୍ୟକ କରେ |ଭିଭୋରେ ଦେଖାଯାଇଥିବା αS ଧାରଣକାରୀ କଣ୍ଡେନ୍ସେଟ୍ ଏହି କିମ୍ବା ଅନ୍ୟାନ୍ୟ LLPS ପ୍ରକ୍ରିୟା ଦ୍ formed ାରା ଗଠିତ ହୋଇଛି କି ନାହିଁ ଏକ ପ୍ରମୁଖ ସମାଧାନ ହୋଇନଥିବା ସମସ୍ୟା ହୋଇ ରହିଛି |ସେହିଭଳି, ଯଦିଓ PD ଏବଂ ଅନ୍ୟାନ୍ୟ ସିନୁକ୍ଲିନୋପାଥିରେ ନ୍ୟୁରନ୍ ଗୁଡିକରେ αS ଆମିଲଏଡ୍ ଏଗ୍ରିଗେସନ୍ ପରିଲକ୍ଷିତ ହୋଇଛି, ସଠିକ୍ ଯନ୍ତ୍ରକ which ଶଳ ଯାହା ଦ୍ α ାରା αS ଇଣ୍ଟ୍ରାସେଲୁଲାର୍ ଆମିଲଏଡ୍ ଏଗ୍ରିଗେସନ୍ ଦେଇଥାଏ, କାରଣ ଏହି ପ୍ରୋଟିନର ଅତ୍ୟଧିକ ସଙ୍କୋଚନ ନିଜେ ଏହି ପ୍ରକ୍ରିୟାକୁ ପ୍ରବର୍ତ୍ତାଇବା ପରି ଦେଖାଯାଏ ନାହିଁ |ଅତିରିକ୍ତ ସେଲ୍ୟୁଲାର୍ କ୍ଷତି ପ୍ରାୟତ required ଆବଶ୍ୟକ ହୁଏ, ପରାମର୍ଶ ଦେଇଥାଏ ଯେ ଇଣ୍ଟ୍ରାସେଲୁଲାର୍ αS ଆମିଲଏଡ୍ ଆସେମ୍ବଲିଗୁଡିକର ପୁନ uc ନିର୍ମାଣ ପାଇଁ କିଛି ସେଲୁଲାର୍ ଅବସ୍ଥାନ କିମ୍ବା ମାଇକ୍ରୋ ପରିବେଶ ଆବଶ୍ୟକ |ଗୋଟିଏ ସେଲ୍ୟୁଲାର୍ ପରିବେଶ ଯାହା ବିଶେଷ ଭାବରେ ଏକୀକରଣରେ ପ୍ରବୃତ୍ତ ହୋଇପାରେ ପ୍ରୋଟିନ୍ କଣ୍ଡେନ୍ସେଟ୍ 23 ର ଭିତର ଅଂଶ |
କ Interest ତୁହଳର ବିଷୟ, ପାର୍କିନ୍ସନ୍ ରୋଗ ଏବଂ ଅନ୍ୟାନ୍ୟ ସିନୁକ୍ଲିନୋପାଥି 24,25 ଥିବା ମଣିଷମାନଙ୍କ ମଧ୍ୟରେ ଚରିତ୍ରଗତ ରୋଗ ଅନ୍ତର୍ଭୂକ୍ତିରେ αS ଏବଂ ta ମିଳିତ ଭାବରେ ଲୋକାଲାଇଜ୍ ହୋଇଥିବା ଜଣାପଡିଛି ଏବଂ ପରୀକ୍ଷଣଗୁଡିକ ଦୁଇଟି ପ୍ରୋଟିନ୍ ମଧ୍ୟରେ ଏକ ସିନର୍ଜିଷ୍ଟିକ୍ ପାଥୋଲୋଜିକାଲ୍ ସମ୍ପର୍କ ବିଷୟରେ ଜଣାଇଛନ୍ତି 26,27 ଏକତ୍ରିକରଣ αS ଏବଂ ନ୍ୟୁରୋଡେଜେନେରେଟିଭ୍ ରୋଗରେ ଟାଉ |ରୋଗ।ଭିଟ୍ରୋ ଏବଂ ଭିଭୋରେ 28,29 ରେ ପରସ୍ପରର ଏକୀକରଣ ଏବଂ ପ୍ରୋତ୍ସାହନ ପାଇଁ αS ଏବଂ tau ମିଳିଲା ଏବଂ ସିନୁକ୍ଲିନୋପାଥି 30 ରୋଗୀଙ୍କ ମସ୍ତିଷ୍କରେ ଏହି ଦୁଇଟି ପ୍ରୋଟିନ୍ ଗଠିତ ହେଟେରୋଜିନସ୍ ଏଗ୍ରିଗେଟ୍ ଦେଖାଗଲା |ତଥାପି, αS ଏବଂ tau ର ପାରସ୍ପରିକ କ୍ରିୟା ଏବଂ ଏହାର ସହ-ଏକୀକରଣର ଯନ୍ତ୍ରକ of ଶଳର ମଲିକୁଲାର ଆଧାର ବିଷୟରେ ଅଳ୍ପ ଜଣା |αS ର ଅତ୍ୟଧିକ ନକାରାତ୍ମକ ଚାର୍ଜ ହୋଇଥିବା ସି-ଟର୍ମିନାଲ୍ ଅଞ୍ଚଳ ଏବଂ ଟାଉର କେନ୍ଦ୍ରୀୟ ପ୍ରୋଲାଇନ୍ ସମୃଦ୍ଧ ଅଞ୍ଚଳ ମଧ୍ୟରେ ଏକ ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋଷ୍ଟାଟିକ୍ ଆକର୍ଷଣ ମାଧ୍ୟମରେ ଟାଉ ସହିତ ଯୋଗାଯୋଗ କରିବାକୁ ରିପୋର୍ଟ କରାଯାଇଛି, ଯାହା ସକରାତ୍ମକ ଚାର୍ଜଯୁକ୍ତ ଅବଶିଷ୍ଟାଂଶରେ ମଧ୍ୟ ସମୃଦ୍ଧ |
ଏହି ଅଧ୍ୟୟନରେ, ଆମେ ଦେଖାଉଛୁ ଯେ αS ପ୍ରକୃତରେ ଟାଉ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଉପସ୍ଥିତିରେ ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋଷ୍ଟାଟିକ୍ ଜଟିଳ ଘନୀଭୂତ ମାଧ୍ୟମରେ ଡ୍ରପଲେଟରେ ବିଭକ୍ତ ହୋଇପାରେ, ପଲି-ଏଲ୍-ଲାଇସେନ୍ (pLK) ପରି ଅନ୍ୟ ସକରାତ୍ମକ ଚାର୍ଜ ହୋଇଥିବା ପଲିପେପ୍ଟାଇଡ୍ ସହିତ ଏହାର ପାରସ୍ପରିକ ବିପରୀତତା ଏବଂ ଏହି ପ୍ରକ୍ରିୟାରେ |dropS ଡ୍ରପଲେଟ୍ ନେଟୱାର୍କ ପାଇଁ ଏକ ସ୍କାଫୋଲ୍ଡ ଅଣୁ ଭାବରେ କାର୍ଯ୍ୟ କରେ |ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋଷ୍ଟାଟିକ୍ αS କୋକ୍ରେଭେଟ୍ସର ପରିପକ୍ୱତା ପ୍ରକ୍ରିୟାରେ ଆମେ ଉଲ୍ଲେଖନୀୟ ପାର୍ଥକ୍ୟ ଚିହ୍ନଟ କରିଛୁ, ଯାହା କୋଏକର୍ଭେଟ୍ ନେଟୱାର୍କରେ ଜଡିତ ପ୍ରୋଟିନର ପାରସ୍ପରିକ ମୂଲ୍ୟବୋଧ ଏବଂ ଶକ୍ତିର ପାର୍ଥକ୍ୟ ସହିତ ଜଡିତ |କ Interest ତୁହଳର ବିଷୟ, ଆମେ ଦୀର୍ଘ ଦିନର ତରଳ କୋଏକର୍ଭେଟରେ αS ଏବଂ ଟାଉ ଆମିଲଏଡ ପ୍ରୋଟିନର ମିଳିତକରଣକୁ ଦେଖିଲୁ ଏବଂ କିଛି ମୁଖ୍ୟ କାରଣ ଚିହ୍ନଟ କଲୁ ଯାହା ଏହି କୋକ୍ରେଭେଟରେ ଏହି ଦୁଇଟି ପ୍ରୋଟିନର ମିଳିତ ହୋଇପାରେ |ଏଠାରେ ଆମେ ଏହି ପ୍ରକ୍ରିୟାକୁ ବିସ୍ତୃତ ଭାବରେ ବର୍ଣ୍ଣନା କରୁ, ଯାହା ରୋଗ-ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ଅନ୍ତର୍ଭୂକ୍ତିରେ ଦୁଇଟି ପ୍ରୋଟିନର କୋଲୋକାଲାଇଜେସନ୍ ଅନ୍ତର୍ଗତ ଏକ ସମ୍ଭାବ୍ୟ ମଲିକୁଲାର ପ୍ରଣାଳୀ |
neutralS ରେ ନିରପେକ୍ଷ pH (ଚିତ୍ର 1a) ରେ ଏକ ଅତ୍ୟଧିକ ଆୟନିକ୍ ସି-ଟର୍ମିନାଲ୍ ଲାଞ୍ଜ ଅଛି, ଏବଂ ଆମେ ଅନୁମାନ କରିଛୁ ଯେ ଏହା ପଲିଷ୍ଟିକିକ୍ ବିକୃତ ପଲିପେପ୍ଟାଇଡ୍ ଅଣୁଗୁଡ଼ିକ ସହିତ ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋଷ୍ଟାଟିକ୍ କମ୍ପ୍ଲେକ୍ସଗୁଡିକର ଘନତ୍ୱ ମାଧ୍ୟମରେ LLPS ଅତିକ୍ରମ କରିପାରେ |ନିରପେକ୍ଷ pH 32 ରେ ଏହାର ସକରାତ୍ମକ ଚାର୍ଜ ଏବଂ ବିଶୃଙ୍ଖଳିତ ପଲିମେରିକ୍ ପ୍ରକୃତି ହେତୁ ଆମେ ଏକ 100-ଅବଶିଷ୍ଟ ପଲି-ଏଲ୍-ଲାଇସେନ୍ (pLK) କୁ ପ୍ରାରମ୍ଭିକ ମଡେଲ୍ ଅଣୁ ଭାବରେ ବ୍ୟବହାର କରିଥିଲୁ | ବ increasing ୁଥିବା αS: pLK ମୋଲାର ଅନୁପାତର ଉପସ୍ଥିତିରେ 13C / 15N- ଲେବଲ୍ αS ବ୍ୟବହାର କରି (ଚିତ୍ର 1 ବି) |SS ର Ct- ଡୋମେନ୍ ସହିତ pLK ର ପାରସ୍ପରିକ କ୍ରିୟା ରାସାୟନିକ ପରିବର୍ତ୍ତନ ଏବଂ ପ୍ରୋଟିନର ଏହି ଅଞ୍ଚଳରେ ଶିଖର ତୀବ୍ରତା ହ୍ରାସ କରିବାରେ ନିଜକୁ ଦର୍ଶାଏ |କ Interest ତୁହଳର ବିଷୟ, ଯେତେବେଳେ ଆମେ αS କୁ pLK ସହିତ ପାଖାପାଖି αS ଏକାଗ୍ରତାରେ ମିଶ୍ରଣ କରିଥିଲୁ |ପଲିଥିନ୍ ଗ୍ଲାଇକଲ୍ (5-15% PEG-8) ର ଉପସ୍ଥିତିରେ 5–25 µM (ସାଧାରଣ LLPS ବଫର୍: 10 ମିମି HEPES pH 7.4, 100 ମିମି NaCl, 15% PEG-8) ଆମେ ତୁରନ୍ତ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଗଠନର ଏକ ବିସ୍ତୃତ କ୍ଷେତ୍ର ଦେଇ ଗଲୁ | ।ଫ୍ଲୋରୋସେନ୍ସ (WF) ଏବଂ ଉଜ୍ଜ୍ୱଳ କ୍ଷେତ୍ର (BF) ମାଇକ୍ରୋସ୍କୋପି (ଚିତ୍ର 1c) ବ୍ୟବହାର କରି ବୁନ୍ଦା ଦେଖାଗଲା |ଏକାଗ୍ର αS ଧାରଣ କରିଥିବା 1-5 µm ବୁନ୍ଦା (1 µM ଆଲେକ୍ସା ଫ୍ଲୋର 488-ଲେବଲ୍ αS, AF488-αS) ଧାରଣ କରିଛି, ସେମାନଙ୍କର ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋଷ୍ଟାଟିକ୍ ଗୁଣଗୁଡିକ 10% 1,6-ହେକ୍ସାନେଡିଅଲ୍ (1,6-HD) ପ୍ରତିରୋଧରୁ ଉତ୍ପନ୍ନ ହୋଇପାରେ | NaCl ଏକାଗ୍ରତା ବୃଦ୍ଧି (ଚିତ୍ର 1c) |MillS / pLK ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋଷ୍ଟାଟିକ୍ କମ୍ପ୍ଲେକ୍ସର କୋଏକର୍ଭେଟ୍ସର ତରଳ ପରି ପ୍ରକୃତି ମିଲିସେକେଣ୍ଡ ମଧ୍ୟରେ ଫ୍ୟୁଜ୍ କରିବାର କ୍ଷମତା ଦ୍ୱାରା ପ୍ରଦର୍ଶିତ ହୁଏ (ଚିତ୍ର 1d) |ଟର୍ବିଡିମିଟ୍ରି ବ୍ୟବହାର କରି, ଆମେ ଏହି ଅବସ୍ଥାରେ ବୁନ୍ଦା ଗଠନକୁ ପରିମାଣ କରିଥିଲୁ, ଏହାର ସ୍ଥିରତା ସହିତ ଜଡିତ ମୁଖ୍ୟ ପାରସ୍ପରିକ କାର୍ଯ୍ୟର ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋଷ୍ଟାଟିକ୍ ପ୍ରକୃତି ନିଶ୍ଚିତ କରିଥିଲୁ (ଚିତ୍ର 1e), ଏବଂ LLPS ପ୍ରକ୍ରିୟାରେ ବିଭିନ୍ନ ପଲିମର ଅନୁପାତର ପ୍ରଭାବକୁ ମୂଲ୍ୟାଙ୍କନ କରିଥିଲୁ (ଚିତ୍ର 1f) |ଯଦିଓ ବହୁ ପରିମାଣର ପଲିମର ଅନୁପାତରେ ଡ୍ରପଲେଟ୍ ଗଠନ ପରିଲକ୍ଷିତ ହୁଏ, pLK αS ରୁ ଅଧିକ ହେଲେ ପ୍ରକ୍ରିୟା ଅତ୍ୟନ୍ତ ଅନୁକୂଳ ଅଟେ |କେମିକାଲ୍ ଭିନ୍ନ ଡିସପ୍ଲେସିଙ୍ଗ୍ ଏଜେଣ୍ଟ ଡେକ୍ସଟ୍ରାନ୍ -70 (70 kDa) ବ୍ୟବହାର କରି କିମ୍ବା ବିଭିନ୍ନ ନମୁନା ଫର୍ମାଟ୍ ବ୍ୟବହାର କରି ଗ୍ଲାସ୍ ସ୍ଲାଇଡ୍ ଡ୍ରପ୍, ବିଭିନ୍ନ ସାମଗ୍ରୀର ମାଇକ୍ରୋପ୍ଲେଟ୍ କୂଅ, ଏପେଣ୍ଡୋର୍ଫ କିମ୍ବା କ୍ୱାର୍ଟଜ୍ କ୍ୟାପିଲାରୀ ବ୍ୟବହାର କରି LLP ଗୁଡିକ ମଧ୍ୟ ପାଳନ କରାଯାଇଛି |
ଏହି ଅଧ୍ୟୟନରେ ବ୍ୟବହୃତ WT-αS ଏବଂ ΔCt-αS ପ୍ରକାରରେ ବିଭିନ୍ନ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଅଞ୍ଚଳର ଏକ ସ୍କିମେଟିକ୍ ଉପସ୍ଥାପନା |ଆମ୍ଫିପାଥିକ୍ ଏନ-ଟର୍ମିନାଲ୍ ଡୋମେନ୍, ହାଇଡ୍ରୋଫୋବିକ୍ ଆମିଲଏଡ୍ ଗଠନ (NAC) ଅଞ୍ଚଳ ଏବଂ ନକାରାତ୍ମକ ଚାର୍ଜ ହୋଇଥିବା ସି-ଟର୍ମିନାଲ୍ ଡୋମେନ୍ ଯଥାକ୍ରମେ ନୀଳ, କମଳା ଏବଂ ନାଲି ରଙ୍ଗରେ ପ୍ରଦର୍ଶିତ ହୋଇଛି |WT-αS ର ନେଟ୍ ଚାର୍ଜ ପ୍ରତି ଅବଶିଷ୍ଟ (NCPR) ମାନଚିତ୍ର ଦେଖାଯାଇଛି |b ମାକ୍ରୋମୋଲ୍ୟୁକୁଲାର କ୍ଲମ୍ପଗୁଡିକର ଅନୁପସ୍ଥିତିରେ αS / pLK ପାରସ୍ପରିକ କାର୍ଯ୍ୟର NMR ବିଶ୍ଳେଷଣ |ଯେହେତୁ pLK ଏକାଗ୍ରତା ବ increases େ (αS: 1: 0.5, 1: 1.5, ଏବଂ 1:10 ର pLK ମୋଲାର ଅନୁପାତ ଯଥାକ୍ରମେ ହାଲୁକା ସବୁଜ, ସବୁଜ ଏବଂ ଗା dark ସବୁଜ ରଙ୍ଗରେ ଦେଖାଯାଏ) |c Coacervate αS / pLK (ମୋଲାର ଅନୁପାତ 1:10) 25 µM (1 µM AF488- ଲେବଲ୍ αS କିମ୍ବା WF ଇମେଜିଙ୍ଗ୍ ପାଇଁ Atto647N- ଲେବଲ୍ pLK) LLPS ବଫର୍ (ଉପର) କିମ୍ବା 500 mM NaCl (ତଳ ବାମ) କିମ୍ବା 10 ପରେ ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟ ହୋଇଛି | % 1,6-hexanediol (1,6-HD; ତଳ ଡାହାଣ) |ମାପ ଦଣ୍ଡ = 20 µm |d 25 μM ର ଏକାଗ୍ରତାରେ αS / pLK (ମୋଲାର ଅନୁପାତ 1:10) ର BF ଡ୍ରପଲେଟ୍ ଫ୍ୟୁଜନର ପ୍ରତିନିଧୀ ମାଇକ୍ରୋସ୍କୋପିକ୍ ଚିତ୍ର |ତୀରଗୁଡ଼ିକ 200 ମିସ ମଧ୍ୟରେ ଏକ ନୂତନ ଡ୍ରପ (କମଳା ତୀର) ରେ ବ୍ୟକ୍ତିଗତ ବୁନ୍ଦା (ଲାଲ ଏବଂ ହଳଦିଆ ତୀର) ର ମିଶ୍ରଣକୁ ସୂଚିତ କରେ |ମାପ ଦଣ୍ଡ = 20 µm |e ହାଲୁକା ବିଛାଇବା (350 nm ରେ) αS / pLK ଏଗ୍ରିଗେସନ୍ LLPS ବଫର୍ରେ 500 mM NaCl କିମ୍ବା 10 µ 1,6-HD ଯୋଗକରିବା ପୂର୍ବରୁ ଏବଂ ପରେ 25 µM αS (N = 3 ନମୁନା ନକଲ, ଅର୍ଥ ଏବଂ ମାନକ ବିଘ୍ନ ମଧ୍ୟ ସୂଚିତ) |f BF ପ୍ରତିଛବି (ଉପର) ଏବଂ ହାଲୁକା ବିଛାଇବା ବିଶ୍ଳେଷଣ (350 nm, ତଳ) αS / pLK ଏକୀକରଣର 25 μM αS ରେ αS ବୃଦ୍ଧି ସହିତ: pLK ମୋଲାର ଅନୁପାତ (N = 3 ନମୁନା ନକଲ, ଅର୍ଥ ଏବଂ ମାନକ ବିଘ୍ନ ମଧ୍ୟ ସୂଚିତ) |ମାପ ଦଣ୍ଡ = 10 µ ମି।ଗୋଟିଏ ପ୍ରତିଛବିରେ ଥିବା ସ୍କେଲ୍ ବାର୍ ଗୋଟିଏ ପ୍ୟାନେଲରେ ଥିବା ସମସ୍ତ ପ୍ରତିଛବିଗୁଡିକର ସ୍କେଲକୁ ସୂଚିତ କରେ |କଞ୍ଚା ତଥ୍ୟ ଫାଇଲ ଆକାରରେ କଞ୍ଚା ତଥ୍ୟ ପ୍ରଦାନ କରାଯାଇଛି |
ଆମର αS / pLK ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋଷ୍ଟାଟିକ୍ ଜଟିଳ ଘନତ୍ୱ ଏବଂ tau / RNA କଣ୍ଡେନ୍ସେଟର କ୍ଲାଏଣ୍ଟ ଅଣୁ ଭାବରେ tau ର ପୂର୍ବ ପର୍ଯ୍ୟବେକ୍ଷଣ ଉପରେ ଆଧାର କରି, ଆମେ ଅନୁମାନ କରିଛୁ ଯେ αS ଏବଂ ta RNA ଅନୁପସ୍ଥିତିରେ ଦ୍ରବଣ ସହିତ ଏକତ୍ର ହୋଇପାରେ | ଘନତ୍ୱଇଲେକ୍ଟ୍ରୋଷ୍ଟାଟିକ୍ କମ୍ପ୍ଲେକ୍ସ ମାଧ୍ୟମରେ, ଏବଂ αS ହେଉଛି αS / Tau coacervates ରେ ଥିବା ସ୍କାଫୋଲ୍ଡ ପ୍ରୋଟିନ୍ (ଚିତ୍ର 2e ରେ ଟାଉ ଚାର୍ଜ ବଣ୍ଟନ ଦେଖନ୍ତୁ) |ଆମେ ଦେଖିଲୁ ଯେ ଯେତେବେଳେ 10 μM αS ଏବଂ 10 μM Tau441 (ଯଥାକ୍ରମେ 1 μM AF488-αS ଏବଂ 1 μM Atto647N-Tau ଧାରଣ କରେ) LLPS ବଫରରେ ମିଶ୍ରିତ ହେଲା, ସେମାନେ ସହଜରେ ଉଭୟ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଧାରଣ କରିଥିବା ପ୍ରୋଟିନ୍ ଏଗ୍ରିଗେଟ୍ ଗଠନ କଲେ, ଯେପରି WF ମାଇକ୍ରୋସ୍କୋପି ଦ୍ୱାରା ଦେଖାଯାଏ |(ଚିତ୍ର 2a)ବୁନ୍ଦା ରେ ଥିବା ଦୁଇଟି ପ୍ରୋଟିନର କୋଲୋକାଲାଇଜେସନ୍ କନଫୋକାଲ୍ (CF) ମାଇକ୍ରୋସ୍କୋପି (ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 1a) ଦ୍ୱାରା ନିଶ୍ଚିତ କରାଯାଇଥିଲା |ସମାନ ଆଚରଣ ପରିଲକ୍ଷିତ ହୋଇଥିଲା ଯେତେବେଳେ ଡେକ୍ସଟ୍ରାନ୍ -70 ଏକୀକରଣ ଏଜେଣ୍ଟ ଭାବରେ ବ୍ୟବହୃତ ହୋଇଥିଲା (ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 1c) |FITC- ଲେବଲ୍ ହୋଇଥିବା PEG କିମ୍ବା ଡେକ୍ସଟ୍ରାନ୍ ବ୍ୟବହାର କରି, ଆମେ ଜାଣିଲୁ ଯେ ଉଭୟ ଭିଡ଼ ଏଜେଣ୍ଟଗୁଡିକ ନମୁନାରେ ସମାନ ଭାବରେ ବଣ୍ଟନ ହୋଇଥିଲେ, ନା ପୃଥକତା କିମ୍ବା ସଙ୍ଗଠନ ଦେଖାଉ ନଥିଲେ (ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 1d) |ଏହା ପରିବର୍ତ୍ତେ, ଏହା ସୂଚିତ କରେ ଯେ ଏହି ସିଷ୍ଟମରେ ସେମାନେ ମାକ୍ରୋମୋଲ୍ୟୁକୁଲାର ଭିଡ଼ ଇଫେକ୍ଟ ମାଧ୍ୟମରେ ପର୍ଯ୍ୟାୟ ପୃଥକତାକୁ ପ୍ରୋତ୍ସାହିତ କରନ୍ତି, ଯେହେତୁ ଅନ୍ୟ LLP ସିଷ୍ଟମରେ ଦେଖାଯାଇଥିବା ପରି PEG ଏକ ପସନ୍ଦଯୋଗ୍ୟ ସ୍ଥିର ଭିଡ଼ ଏଜେଣ୍ଟ ଅଟେ |ଏହି ପ୍ରୋଟିନ୍ ସମୃଦ୍ଧ ବୁନ୍ଦା NaCl (1 M) ପ୍ରତି ସମ୍ବେଦନଶୀଳ ଥିଲା କିନ୍ତୁ 1,6-HD (10% v / v) ନୁହେଁ, ସେମାନଙ୍କର ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋଷ୍ଟାଟିକ୍ ଗୁଣଗୁଡିକ (ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 2a, b) ନିଶ୍ଚିତ କରେ |BF ମାଇକ୍ରୋସ୍କୋପି (ଚିତ୍ର 2 ବି) ବ୍ୟବହାର କରି ମିଲିସେକେଣ୍ଡ ମିଶ୍ରଣ ଡ୍ରପଲେଟ୍ ଇଭେଣ୍ଟଗୁଡିକ ଦେଖି ସେମାନଙ୍କର ତରଳ ଆଚରଣ ନିଶ୍ଚିତ କରାଯାଇଥିଲା |
LLPS ବଫରରେ αS / Tau441 coacervates ର ଏକ କନଫୋକାଲ୍ (CF) ମାଇକ୍ରୋସ୍କୋପି ପ୍ରତିଛବି (ପ୍ରତ୍ୟେକ ପ୍ରୋଟିନର 10 μM, AF488- ଲେବଲ୍ αS ଏବଂ Atto647N- ଲେବଲ୍ Tau441) |b αS / Tau441 ଡ୍ରପଲେଟ୍ ଫ୍ୟୁଜନ୍ ଇଭେଣ୍ଟଗୁଡିକର ପ୍ରତିନିଧୀ ଭିନ୍ନକ୍ଷମ ହସ୍ତକ୍ଷେପ ବିପରୀତ (DIC) ପ୍ରତିଛବିଗୁଡିକ (ପ୍ରତ୍ୟେକ ପ୍ରୋଟିନ୍ ପାଇଁ 10 μM) |c Tau441 LLPS (0-15 µM) ର ହାଲୁକା ବିଛାଇବା (350 nm ରେ) ଉପରେ ପର୍ଯ୍ୟାୟ ଚିତ୍ର 50 µM αS ର ଅନୁପସ୍ଥିତିରେ (ବାମ) କିମ୍ବା ଉପସ୍ଥିତିରେ (ଡାହାଣ) |ଉଷ୍ମ ରଙ୍ଗ ଅଧିକ ବିଛାଇବା ସୂଚାଇଥାଏ |d increasingS ଏକାଗ୍ରତା ସହିତ TaS / Tau441 LLPS ନମୁନାଗୁଡ଼ିକର ହାଲୁକା ବିଛାଇବା (Tau441 5 µM, N = 2-3 ନମୁନା ପୁନରାବୃତ୍ତି) |e ଏହି ଅଧ୍ୟୟନରେ ବ୍ୟବହୃତ ପ୍ରୋଟିନର ବିଭିନ୍ନ ଟାଉ ପ୍ରୋଟିନ୍ ପ୍ରକାର ଏବଂ ବିଭିନ୍ନ ଅଞ୍ଚଳର ସ୍କିଜେଟିକ୍ ଉପସ୍ଥାପନା: ନକାରାତ୍ମକ ଭାବରେ ଚାର୍ଜ ହୋଇଥିବା N- ଟର୍ମିନାଲ୍ ଡୋମେନ୍ (ଲାଲ୍), ପ୍ରୋଲାଇନ୍ ସମୃଦ୍ଧ ଅଞ୍ଚଳ (ନୀଳ), ମାଇକ୍ରୋଟ୍ୟୁବୁଲ୍-ବାଇଣ୍ଡିଂ ଡୋମେନ୍ (MTBD, କମଳା ରଙ୍ଗରେ ହାଇଲାଇଟ୍), ଏବଂ ଆମିଲଏଡ୍ ଗଠନକାରୀ ଯୋଡି ସ୍ପିରାଲ୍ |MTBD (ଧୂସର) ମଧ୍ୟରେ ଅବସ୍ଥିତ ଚିଲାମେଣ୍ଟ ଅଞ୍ଚଳ (PHF) |Tau441 ର ନିଟ୍ ଚାର୍ଜ ପ୍ରତି ଅବଶିଷ୍ଟ (NCPR) ମାନଚିତ୍ର ଦେଖାଯାଇଛି |f 1 µM AF488- ଲେବଲ୍ αS ଏବଂ Atto647N- ଲେବଲ୍ ହୋଇଥିବା ΔNt- ବ୍ୟବହାର କରି, 1NM-AF488- ଲେବଲ୍ αS କିମ୍ବା ΔCt-αS ବ୍ୟବହାର କରି tNt-Tau (ଉପର, ପ୍ରୋଟିନ୍ ପ୍ରତି 10 µM) କିମ୍ବା K18 (ତଳ, ପ୍ରୋଟିନ୍ ପ୍ରତି 50 µM) | ))) LLPS କିମ୍ବା K18 ବଫରରେ ଘନୀଭୂତ WF ର ମାଇକ୍ରୋଗ୍ରାଫ୍ |ଗୋଟିଏ ପ୍ରତିଛବିରେ ଥିବା ସ୍କେଲ୍ ବାରଗୁଡିକ ଗୋଟିଏ ପ୍ୟାନେଲରେ ଥିବା ସମସ୍ତ ପ୍ରତିଛବିଗୁଡିକର ସ୍କେଲ୍କୁ ପ୍ରତିନିଧିତ୍ୱ କରେ (ପ୍ୟାନେଲ୍ a, b ଏବଂ f ପାଇଁ 20 µm) |ପ୍ୟାନେଲ୍ c ଏବଂ d ପାଇଁ କଞ୍ଚା ତଥ୍ୟ କଞ୍ଚା ଡାଟା ଫାଇଲ୍ ଭାବରେ ପ୍ରଦାନ କରାଯାଇଛି |
ଏହି LLPS ପ୍ରକ୍ରିୟାରେ αS ର ଭୂମିକା ପରୀକ୍ଷା କରିବାକୁ, ଆମେ ପ୍ରଥମେ NaCl ର ଚିତ୍ର (ଚିତ୍ର 2c) ବ୍ୟବହାର କରି ନେଫେଲୋମେଟ୍ରୀ ଦ୍ୱାରା ଡ୍ରପଲେଟ୍ ସ୍ଥିରତା ଉପରେ αS ର ପ୍ରଭାବ ଅନୁସନ୍ଧାନ କରିଥିଲୁ |SS ଧାରଣ କରିଥିବା ନମୁନାରେ ଲୁଣର ଏକାଗ୍ରତା ଯେତେ ଅଧିକ, ହାଲୁକା ବିଛାଇବା ମୂଲ୍ୟ (350 nm ରେ) ଅଧିକ, ଯାହା ଏହି LLPS ସିଷ୍ଟମରେ αS ର ସ୍ଥିରକାରୀ ଭୂମିକାକୁ ସୂଚିତ କରେ |ସମାନ ପ୍ରଭାବ αS ଏକାଗ୍ରତା (ଏବଂ ସେଥିପାଇଁ αS: Tau441 ଅନୁପାତ) କୁ ବୃଦ୍ଧି କରି ପାଳନ କରାଯାଇପାରେ |ଟାଉ ଏକାଗ୍ରତା (5 µM) ସହିତ 10 ଗୁଣା ବୃଦ୍ଧି (ଚିତ୍ର 2d) |CoS କୋଏକର୍ଭେଟରେ ଏକ ସ୍କାଫୋଲ୍ଡ ପ୍ରୋଟିନ୍ ବୋଲି ଦର୍ଶାଇବାକୁ, ଆମେ LLPS- ବ୍ୟାହତ ଟାଉ ମ୍ୟୁଟାଣ୍ଟର ଆଚରଣ ଅନୁସନ୍ଧାନ କରିବାକୁ ସ୍ଥିର କଲୁ, ଯେଉଁଥିରେ ନକାରାତ୍ମକ ଚାର୍ଜ ହୋଇଥିବା N- ଟର୍ମିନାଲ୍ ଅଞ୍ଚଳ (ଅବଶିଷ୍ଟ 1–150, ଚିତ୍ର 2e ଦେଖନ୍ତୁ) ΔNt-Tau କୁହାଯାଏ |WF ମାଇକ୍ରୋସ୍କୋପି ଏବଂ ନେଫେଲୋମେଟ୍ରି ନିଶ୍ଚିତ କରିଛି ଯେ tNt-Tau ନିଜେ LLPS (ଚିତ୍ର 2f ଏବଂ ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଡ଼ିମ୍। 2d) ଦେଇନାହାଁନ୍ତି, ଯେପରି ପୂର୍ବରୁ ରିପୋର୍ଟ କରାଯାଇଥିଲା 14 | ସମାନ ଅବସ୍ଥାରେ ଏବଂ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଏକାଗ୍ରତାରେ ଟାଉ ଏବଂ αS ର ପୂର୍ଣ୍ଣ ଆକାରର ସମାଧାନର ଡ୍ରପଲେଟ୍ ସାନ୍ଧ୍ରତା ସହିତ ଡ୍ରପଲେଟ୍ ସାନ୍ଧ୍ରତା ସହିତ ପୁନ restored ସ୍ଥାପିତ |ନିମ୍ନ ମାକ୍ରୋମୋଲ୍ୟୁକୁଲାର ଭିଡ଼ (ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 2c) ପରିସ୍ଥିତିରେ ମଧ୍ୟ ଏହି ପ୍ରକ୍ରିୟା ପାଳନ କରାଯାଇପାରେ |ସି-ଟର୍ମିନାଲ୍ αS ଅଞ୍ଚଳର ଭୂମିକା, କିନ୍ତୁ ଏହାର ସମ୍ପୂର୍ଣ୍ଣ ଦ length ର୍ଘ୍ୟ ନୁହେଁ, LLPS ପ୍ରକ୍ରିୟାରେ (ΔCt-) ର C- ଟର୍ମିନାଲ୍ ଛୋଟ αS ପ୍ରକାରକୁ ବ୍ୟବହାର କରି ଡ୍ରପଲେଟ୍ ଗଠନକୁ ପ୍ରତିବନ୍ଧକ ଦ୍ୱାରା ପ୍ରଦର୍ଶନ କରାଯାଇଥିଲା | αS) ପ୍ରୋଟିନ୍ (ଚିତ୍ର 2f ଏବଂ ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 2d) |କନଫୋକାଲ୍ ଫ୍ଲୋରୋସେନ୍ସ ମାଇକ୍ରୋସ୍କୋପି (ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 1 ବି) ଦ୍ୱାରା αS ଏବଂ tNt-Tau ର କୋଲୋକାଲାଇଜେସନ୍ ନିଶ୍ଚିତ କରାଯାଇଥିଲା |
Tau441 ଏବଂ αS ମଧ୍ୟରେ LLPS ଯାନ୍ତ୍ରିକତାକୁ ପରୀକ୍ଷଣ କରିବା ପାଇଁ, ଏକ ଅତିରିକ୍ତ ଟାଉ ପ୍ରକାର ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇଥିଲା, ଯଥା ମାଇକ୍ରୋଟ୍ୟୁବୁଲ୍-ବାଇଣ୍ଡିଂ ଡୋମେନ୍ (MTBD) ରେ ଯୋଡି ହୋଇଥିବା ହେଲିକାଲ୍ ଫିଲାମାଣ୍ଟ କୋର୍ (PHF) ଖଣ୍ଡ, ଯାହା ଯଦି ଚାରୋଟି ଚରିତ୍ର ପୁନରାବୃତ୍ତି ଡୋମେନ୍ ଧାରଣ କରେ, ସାଧାରଣତ known ଜଣାଶୁଣା | K18 ଖଣ୍ଡ ଭାବରେ (ଚିତ୍ର 2e ଦେଖନ୍ତୁ) |ନିକଟରେ ରିପୋର୍ଟ କରାଯାଇଛି ଯେ ମାଇକ୍ରୋଟ୍ୟୁବୁଲ୍-ବାଇଣ୍ଡିଂ ଡୋମେନ୍ ପୂର୍ବରୁ ଏକ କ୍ରମରେ ପ୍ରୋଲାଇନ୍ ସମୃଦ୍ଧ ଡୋମେନ୍ରେ ଅବସ୍ଥିତ ଏକ ଟାଉ ପ୍ରୋଟିନ୍ ସହିତ αS ପସନ୍ଦ କରେ |ଅବଶ୍ୟ, PHF ଅଞ୍ଚଳ ମଧ୍ୟ ସକରାତ୍ମକ ଚାର୍ଜ ହୋଇଥିବା ଅବଶିଷ୍ଟାଂଶରେ ଭରପୂର ଅଟେ (ଚିତ୍ର 2e ଦେଖନ୍ତୁ), ବିଶେଷତ l ଲାଇସେନ୍ (15% ଅବଶିଷ୍ଟାଂଶ), ଯାହା ଆମକୁ ପରୀକ୍ଷା କରିବାକୁ କହିଲା ଯେ ଏହି ଅଞ୍ଚଳ αS / Tau କମ୍ପ୍ଲେକ୍ସର ଘନୀକରଣରେ ମଧ୍ୟ ସହାୟକ ହୁଏ କି?ଆମେ ଦେଖିଲୁ ଯେ ପରୀକ୍ଷିତ ଅବସ୍ଥାରେ 100 μM ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ ଏକାଗ୍ରତାରେ K18 କେବଳ LLPS ଟ୍ରିଗର କରିପାରିବ ନାହିଁ (15% PEG କିମ୍ବା 20% ଡେକ୍ସଟ୍ରାନ୍ ସହିତ LLPS ବଫର୍) (ଚିତ୍ର 2f) |ଅବଶ୍ୟ, ଯେତେବେଳେ ଆମେ 50 µM αS କୁ 50 µM K18 ରେ ଯୋଡିଥିଲୁ, K18 ଏବଂ αS ଧାରଣ କରିଥିବା ପ୍ରୋଟିନ୍ ବୁନ୍ଦା ର ଶୀଘ୍ର ଗଠନ ନେଫେଲୋମେଟ୍ରୀ (ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 2d) ଏବଂ WF ମାଇକ୍ରୋସ୍କୋପି (ଚିତ୍ର 2f) ଦ୍ୱାରା ଦେଖାଗଲା |ଆଶା କରାଯାଉଥିବା ପରି, ΔCt-αS K18 ର LLPS ଆଚରଣକୁ ପୁନ restore ସ୍ଥାପନ କରିବାରେ ଅସମର୍ଥ ହେଲା (ଚିତ୍ର 2f) |ଆମେ ଧ୍ୟାନ ଦେଉଛୁ ଯେ αS / KNt-Tau କିମ୍ବା αS / Tau441 ତୁଳନାରେ LLPS କୁ ପ୍ରବର୍ତ୍ତାଇବା ପାଇଁ αS / K18 ଏଗ୍ରିଗେସନ୍ ସାମାନ୍ୟ ଅଧିକ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଏକାଗ୍ରତା ଆବଶ୍ୟକ କରେ |ମାଇକ୍ରୋଟ୍ୟୁବୁଲ୍-ବାଇଣ୍ଡିଂ ଡୋମେନ୍ ତୁଳନାରେ ପ୍ରୋଲାଇନ୍ ସମୃଦ୍ଧ ଟାଉ ଡୋମେନ୍ ସହିତ αS ସି-ଟର୍ମିନାଲ୍ ଅଞ୍ଚଳର ଏକ ଶକ୍ତିଶାଳୀ ପାରସ୍ପରିକ କାର୍ଯ୍ୟ ସହିତ ଏହା ସୁସଙ୍ଗତ |
NNt-Tau αS ର ଅନୁପସ୍ଥିତିରେ LLPS ସଂପାଦନ କରିପାରିବ ନାହିଁ, ଆମେ ଏହି Tau ପ୍ରକାରକୁ αS / Tau LLPS କୁ ଚରିତ୍ର କରିବା ପାଇଁ ଏକ ମଡେଲ୍ ଭାବରେ ବାଛିଲୁ, LLPS ସିଷ୍ଟମରେ ଏହାର ସରଳତାକୁ ପୂର୍ଣ୍ଣ ଦ Ta ର୍ଘ୍ୟର Tau (ଆଇସୋଟାଇପ୍, Tau441 / Tau441) |ଜଟିଳ (ହେଟେରୋଟାଇପିକ୍, αS / Tau441) ଏକୀକରଣ ପ୍ରକ୍ରିୟା ସହିତ |ସେଣ୍ଟ୍ରିଫୁଗେସନ୍ ଦ୍ disp ାରା αS / Tau ଏବଂ αS / ΔNt-Tau ସିଷ୍ଟମରେ αS ଏଗ୍ରିଗେସନ୍ (କଣ୍ଡେନ୍ସଡ୍ ଫେଜ୍ ପ୍ରୋଟିନ୍, fαS, c) ର ଡିଗ୍ରୀ ତୁଳନା କରି ଆମେ ସମାନ ମୂଲ୍ୟ ପାଇଲୁ | ସମାନ ଏକାଗ୍ରତାରେ ସମସ୍ତ ପ୍ରୋଟିନ୍ ପାଇଁ |ବିଶେଷ ଭାବରେ, ଆମେ αS / Tau ଏବଂ αS / ΔNt-Tau ପାଇଁ ଯଥାକ୍ରମେ fαS, c 84 ± 2% ଏବଂ 79 ± 7% ହାସଲ କଲୁ, ପରାମର୍ଶ ଦେଉଛୁ ଯେ αS ଏବଂ tau ମଧ୍ୟରେ ହେଟେରୋଟାଇପିକ୍ ପାରସ୍ପରିକ ସମ୍ପର୍କ ଟାଉ ଅଣୁଗୁଡ଼ିକର ପାରସ୍ପରିକ କ୍ରିୟାଠାରୁ ଉତ୍ତମ ଅଟେ |ମଧ୍ୟରେ
ବିଭିନ୍ନ ପଲିକେସନ୍ ସହିତ ପାରସ୍ପରିକ କ୍ରିୟା ଏବଂ αS କିନେଟିକ୍ସ ଉପରେ ଘନୀଭୂତ ପ୍ରକ୍ରିୟାର ପ୍ରଭାବ ପ୍ରଥମେ ଫଟୋଗ୍ରାଫ୍ (FRAP) ପଦ୍ଧତି ପରେ ଫ୍ଲୋରୋସେନ୍ସ ପୁନରୁଦ୍ଧାର ଦ୍ୱାରା ଅଧ୍ୟୟନ କରାଯାଇଥିଲା |ଆମେ αS / Tau441, αS / ΔNt-Tau ଏବଂ αS / pLK coacervates (100 μM αS 2 μM αS AF488-αS ଏବଂ 100 μM Tau441 କିମ୍ବା ΔNt-Tau କିମ୍ବା 1 mM pLK) ପରୀକ୍ଷା କରିଛୁ |ନମୁନା ଉପାଦାନଗୁଡିକ ମିଶ୍ରଣ କରିବା ପରେ ପ୍ରଥମ 30 ମିନିଟ୍ ମଧ୍ୟରେ ତଥ୍ୟ ହାସଲ କରାଯାଇଥିଲା |ପ୍ରତିନିଧୀ FRAP ପ୍ରତିଛବିଗୁଡିକରୁ (ଚିତ୍ର 3a, αS / Tau441 ଘନତ୍ୱ) ଏବଂ ସେମାନଙ୍କର ଅନୁରୂପ ସମୟ ପାଠ୍ୟକ୍ରମ ବକ୍ର (ଚିତ୍ର 3 ବି, ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 3), ଏହା ଦେଖାଯାଇପାରେ ଯେ αS ଗତିଜତା Tau441 କୋକ୍ରେଭେଟ୍ ସହିତ ସମାନ |ଏବଂ tNt-Tau, ଯାହା pLK ସହିତ ବହୁତ ତୀବ୍ର ଅଟେ |FRAP ଅନୁଯାୟୀ କୋଏକର୍ଭେଟ୍ ଭିତରେ αS ପାଇଁ ଗଣିତ ବିସ୍ତାର କୋଏଫେସିଏଣ୍ଟସ୍ (କାଙ୍ଗ ଏଟ୍ ଆଲ୍। 35 ଦ୍ୱାରା ବର୍ଣ୍ଣିତ) ହେଉଛି D = 0.013 ± 0.009 µm2 / s ଏବଂ D = 0.026 ± 0.008 µm2 / s αS / Tau441 ଏବଂ αS / ΔNt- ପାଇଁ | αS / ସିଷ୍ଟମ୍ |pLK, Tau, ଏବଂ D = 0.18 ± 0.04 µm2 / s ଯଥାକ୍ରମେ (ଚିତ୍ର 3c) |ଅବଶ୍ୟ, ବିଛିନ୍ନ ପର୍ଯ୍ୟାୟରେ ବିସ୍ତାର କୋଏଫିସିଣ୍ଟେଣ୍ଟ αS ସମସ୍ତ ଘନୀଭୂତ ପର୍ଯ୍ୟାୟ ଅପେକ୍ଷା ଅଧିକ ପରିମାଣର ଅର୍ଡର ଅଟେ, ଯେପରି ଫ୍ଲୋରୋସେନ୍ସ କରିଲେସନ୍ ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରସ୍କୋପି (FCS, ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 3 ଦେଖନ୍ତୁ) ସମାନ ଅବସ୍ଥାରେ (LLPS ବଫର୍) କିନ୍ତୁ ପଲିକେସନ୍ ଅନୁପସ୍ଥିତିରେ | (D = 8 ± 4 µm2 / s) |ଅତଏବ, ଘୋଷିତ ମଲିକୁଲାର ଭିଡ଼ ପ୍ରଭାବ ହେତୁ ବିଛିନ୍ନ ପର୍ଯ୍ୟାୟରେ ଥିବା ପ୍ରୋଟିନ୍ ତୁଳନାରେ coS ଅନୁବାଦର ଗତିଜତା ଯଥେଷ୍ଟ ହ୍ରାସ ପାଇଥାଏ, ଯଦିଓ ସମସ୍ତ କୋକ୍ଭର୍ଭେଟ୍ ଗଠନ ହେବାର ପ୍ରଥମ ଅଧ ଘଣ୍ଟା ମଧ୍ୟରେ ତରଳ ପରି ଗୁଣ ବଜାୟ ରଖିଥାଏ, ଟାଉ ପର୍ଯ୍ୟାୟ ତୁଳନାରେ |pLK କଣ୍ଡେନ୍ସେଟରେ ଦ୍ରୁତ ଗତିଜ |
ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋଷ୍ଟାଟିକ୍ କୋକ୍ରେଭେଟରେ αS ଗତିଶୀଳତା (2% AF488- ଲେବଲ୍ αS) ର - c FRAP ବିଶ୍ଳେଷଣ |ଟ୍ରିପ୍ଲିକେଟରେ αS / Tau441 FRAP ଅନୁଧ୍ୟାନର ପ୍ରତିନିଧୀ ଚିତ୍ରଗୁଡ଼ିକ (କ) ରେ ପ୍ରଦର୍ଶିତ ହୋଇଛି, ଯେଉଁଠାରେ ଲାଲ୍ ବୃତ୍ତଗୁଡ଼ିକ ସଜାଯାଇଥିବା ସ୍ଥାନଗୁଡ଼ିକୁ ସୂଚିତ କରେ |ସ୍କେଲ ବାର୍ ହେଉଛି 5 µm |b ହାରାହାରି FRAP ବକ୍ର ଏବଂ (ଗ) 100 µM αS ଏବଂ Tau441 (ଲାଲ୍) କିମ୍ବା ΔNt-Tau (ନୀଳ) କିମ୍ବା pLK (ସବୁଜ) ର ତିନୋଟି ପରୀକ୍ଷଣରୁ 5–6 (N) ଭିନ୍ନ ବୁନ୍ଦା ପାଇଁ ଗଣିତ ବିସ୍ତାର କୋଏଫେସିଏଣ୍ଟସ୍ (D) ଗଣନା କରାଯାଇଛି | ଦଶଗୁଣରେ LLPS ର ଏକାଗ୍ରତା |FRAP ବକ୍ରର ମାନକ ବିଘ୍ନ ଛାଇ ରଙ୍ଗରେ ଦେଖାଯାଏ |ତୁଳନା ପାଇଁ, ବିଛିନ୍ନ ପର୍ଯ୍ୟାୟରେ ବିସ୍ତାର କୋଏଫିସିଏଣ୍ଟ୍ αS ଫ୍ଲୋରୋସେନ୍ସ କୋଲେଲେସନ୍ ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରସ୍କୋପି (FCS) ବ୍ୟବହାର କରି ଟ୍ରିପ୍ଲିକେଟ୍ ରେ ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରାଯାଇଥିଲା (ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 3 ଏବଂ ଅଧିକ ସୂଚନା ପାଇଁ ପଦ୍ଧତି ଦେଖନ୍ତୁ) |d LLPS ବଫରରେ 100 μM TEMPOL-122-αS ର କ୍ରମାଗତ X- ବ୍ୟାଣ୍ଡ EPR ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରା କ pol ଣସି ପଲିସିସନ୍ (କଳା) କିମ୍ବା 100 μM Tau441 (ଲାଲ୍) କିମ୍ବା ΔNt-Tau (ନୀଳ) କିମ୍ବା 1 mM pLK (ସବୁଜ) ର ଉପସ୍ଥିତିରେ |ଇନସେଟ ଶକ୍ତିଶାଳୀ କ୍ଷେତ୍ର ରେଖାଗୁଡ଼ିକର ଏକ ବର୍ଦ୍ଧିତ ଦୃଶ୍ୟ ଦେଖାଏ ଯେଉଁଠାରେ ସବୁଠାରୁ ନାଟକୀୟ ପରିବର୍ତ୍ତନ ଘଟେ |e LLPS (କ P ଣସି PEG) ଅନୁପସ୍ଥିତିରେ ବିଭିନ୍ନ ପଲିସିସନ୍ ସହିତ 50 μM TEMPOL-122-αS ର ବାନ୍ଧିବା ବକ୍ରଗୁଡିକ |ସାଧାରଣ EPR ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରମର ବ୍ୟାଣ୍ଡ II (IIII / III) ତୁଳନାରେ ବ୍ୟାଣ୍ଡ III ର ହ୍ରାସ ହୋଇଥିବା ପ୍ରଶସ୍ତତା Tau441 (ଲାଲ), ΔNt-Tau (ନୀଳ) ଏବଂ pLK (ସବୁଜ) ର ମୋଲାର ଅନୁପାତ ବ to ାଇବାକୁ ଦର୍ଶାଯାଇଛି |ରଙ୍ଗୀନ ରେଖା ପ୍ରତ୍ୟେକ ବକ୍ରରେ n ସମାନ ଏବଂ ସ୍ independent ାଧୀନ ବାଇଣ୍ଡିଂ ସାଇଟ୍ ସହିତ ଏକ ରୁଗ୍ ବାଇଣ୍ଡିଂ ମଡେଲ୍ ବ୍ୟବହାର କରି ତଥ୍ୟ ସହିତ ଫିଟ୍ ଦେଖାଏ |କଞ୍ଚା ତଥ୍ୟ ଫାଇଲ ଆକାରରେ କଞ୍ଚା ତଥ୍ୟ ପ୍ରଦାନ କରାଯାଇଛି |
ଏକ ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟ ଭାବରେ, ଆମେ ନିର୍ଦ୍ଦେଶିତ ସ୍ପିନ୍ ଲେବେଲିଂ (SDSL) ଏବଂ କ୍ରମାଗତ ଇଲେକ୍ଟ୍ରନ୍ ପାରାମାଗ୍ନେଟିକ୍ ରିଜୋନାନ୍ସ (CW-EPR) ବ୍ୟବହାର କରି ବିଭିନ୍ନ କୋକ୍ରେଭେଟରେ αS ର ଗତିଶୀଳତା ଅନୁସନ୍ଧାନ କରିଥିଲୁ |ଏହି ପଦ୍ଧତି IDP ର ନମନୀୟତା ଏବଂ ଗତିଶୀଳତାକୁ ଏକ ବାସ୍ତବିକ ଅବଶିଷ୍ଟ ରିଜୋଲ୍ୟୁସନ୍ 36,37,38 ରିପୋର୍ଟ କରିବାରେ ଅତ୍ୟନ୍ତ ଉପଯୋଗୀ ବୋଲି ପ୍ରମାଣିତ ହୋଇଛି |ଏହି ଉଦ୍ଦେଶ୍ୟରେ, ଆମେ ସିଙ୍ଗଲ୍ ସିଏସ୍ ମ୍ୟୁଟାଣ୍ଟରେ ସିଷ୍ଟାଇନ୍ ଅବଶିଷ୍ଟାଂଶ ନିର୍ମାଣ କରି 4-ହାଇଡ୍ରୋକ୍ସି-2,2,6,6-ଟେଟ୍ରାମେଥାଇଲପାଇରିଡାଇନ୍-ଏନ-ଅକ୍ସିଲ୍ (TEMPOL) ସ୍ପିନ୍ ପ୍ରୋବ ବ୍ୟବହାର କରିଥିଲୁ |Maleimide derivatives ସେମାନଙ୍କୁ ଲେବଲ୍ କରେ |ଅଧିକ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ଭାବରେ, ଆମେ 122 କିମ୍ବା 24 αS (TEMPOL-122-αS ଏବଂ TEMPOL-24-αS) ସ୍ଥିତିରେ TEMPOL ଅନୁସନ୍ଧାନ ଭର୍ତ୍ତି କରିଛୁ |ପ୍ରଥମ କ୍ଷେତ୍ରରେ, ଆମେ ପ୍ରୋଟିନର ସି-ଟର୍ମିନାଲ୍ ଅଞ୍ଚଳକୁ ଟାର୍ଗେଟ୍ କରୁ, ଯାହା ପଲିକେସନ୍ ସହିତ ପାରସ୍ପରିକ କାର୍ଯ୍ୟରେ ଜଡିତ |ଏହା ପରିବର୍ତ୍ତେ, ପୋଜିସନ୍ 24 ଆମକୁ କଣ୍ଡେନ୍ସେଟରେ ଥିବା ପ୍ରୋଟିନଗୁଡିକର ସାମଗ୍ରିକ ଗତିଶୀଳତା ବିଷୟରେ ସୂଚନା ଦେଇପାରେ |ଉଭୟ କ୍ଷେତ୍ରରେ, ବିଚ୍ଛିନ୍ନ ପର୍ଯ୍ୟାୟର ପ୍ରୋଟିନ୍ ପାଇଁ ପ୍ରାପ୍ତ EPR ସଙ୍କେତ ଦ୍ରୁତ ଗତିଶୀଳ ଅବସ୍ଥାରେ ନାଇଟ୍ରକ୍ସାଇଡ୍ ରେଡିକାଲ୍ ସହିତ ଅନୁରୂପ ଥିଲା |ଟାଉ କିମ୍ବା pLK (100 μM TEMPOL-αS, Tau441 କିମ୍ବା ΔNt-Tau 1: 1 ଅନୁପାତରେ କିମ୍ବା 1:10 ଅନୁପାତରେ pLK) ଙ୍କ ଉପସ୍ଥିତିରେ ପର୍ଯ୍ୟାୟ ପୃଥକତା ପରେ, ଆପେକ୍ଷିକ ଶିଖର ତୀବ୍ରତା ବୃଦ୍ଧି ପାଇଲା | αS ର EPR ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରମ୍ |ହ୍ରାସ ରେଖା ବିସ୍ତାରିତ ହୋଇଛି, ହଳଦିଆ ପର୍ଯ୍ୟାୟରେ ପ୍ରୋଟିନ୍ ତୁଳନାରେ ଡ୍ରପଲେଟରେ αS ପୁନ ori ପରିବର୍ତ୍ତନ କିନେଟିକ୍ସକୁ ସୂଚାଇଥାଏ (ଚିତ୍ର 3d, ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 4a) |122 ସ୍ଥିତିରେ ଏହି ପରିବର୍ତ୍ତନଗୁଡିକ ଅଧିକ ସ୍ପଷ୍ଟ ହୋଇଛି | 24 ସ୍ଥିତିରେ pLK ର ଉପସ୍ଥିତି ଅନୁସନ୍ଧାନର ଗତି ଉପରେ ପ୍ରଭାବ ପକାଇ ନାହିଁ, 122 ସ୍ଥିତିରେ ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରାଲ୍ ଲାଇନ୍ ଆକୃତି ଯଥେଷ୍ଟ ପରିବର୍ତ୍ତନ ହୋଇଛି (ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 4a) |ଯେତେବେଳେ ଆମେ ଆଇସୋଟ୍ରୋପିକ୍ ମଡେଲ୍ (ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 5a) ବ୍ୟବହାର କରି ଦୁଇଟି αS / ପଲିକେସନ୍ ସିଷ୍ଟମର 122 ସ୍ଥିତିରେ ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରାକୁ ମଡେଲ କରିବାକୁ ଚେଷ୍ଟା କରିଥିଲୁ, ସାଧାରଣତ the ସ୍ପିନ୍-ଲେବଲ୍ IDP38,39 ର ଗତିଶୀଳତାକୁ ବର୍ଣ୍ଣନା କରିବା ପାଇଁ ବ୍ୟବହୃତ ହେଉଥିଲୁ, ଆମେ ପରୀକ୍ଷାମୂଳକ ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରାର ପୁନ str ନିର୍ମାଣ କରିବାରେ ଅସମର୍ଥ |।24 ସ୍ପିନ୍ ସ୍ଥିତିର ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରାଲ୍ ସିମୁଲେସନ୍ (ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 5a) |ଏହା ସୂଚିତ କରେ ଯେ ପଲିକେସନ୍ ଉପସ୍ଥିତିରେ αS ର C- ଟର୍ମିନାଲ୍ ଅଞ୍ଚଳର ସ୍ପିନ୍ ବିନ୍ୟାସକରଣ ସ୍ଥାନରେ ଅଗ୍ରାଧିକାର ସ୍ଥିତି ଅଛି |ପରୀକ୍ଷାମୂଳକ EPR ଅବସ୍ଥାରେ (84 ± 2%, 79 ± 7%, ଏବଂ αS / Tau441, αS / ΔNt-Tau, ଏବଂ αS / pLK ପାଇଁ 47 ± 4% ଯଥାକ୍ରମେ ଘନୀଭୂତ ପର୍ଯ୍ୟାୟରେ αS ର ଭଗ୍ନାଂଶ ବିଷୟରେ ବିଚାର କରିବାବେଳେ - ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଦେଖନ୍ତୁ | ତଥ୍ୟ ବିଶ୍ଳେଷଣର ଚିତ୍ର 2e ଗ), ଏହା ଦେଖାଯାଇପାରେ ଯେ EPR ପଦ୍ଧତି ଦ୍ det ାରା ଚିହ୍ନଟ ହୋଇଥିବା ବିସ୍ତାର ମୁଖ୍ୟତ the ଘନୀଭୂତ ପର୍ଯ୍ୟାୟରେ ବିଭିନ୍ନ ପଲିକେସନ୍ ସହିତ αS ର C- ଟର୍ମିନାଲ୍ ଅଞ୍ଚଳର ପାରସ୍ପରିକ କାର୍ଯ୍ୟକୁ ପ୍ରତିଫଳିତ କରିଥାଏ (TEMPOL-122- ବ୍ୟବହାର କରିବା ସମୟରେ ମୁଖ୍ୟ ପରିବର୍ତ୍ତନ | αS), ଏବଂ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଘନୀଭୂତ ନୁହେଁ |ଅନୁସନ୍ଧାନରେ ମାଇକ୍ରୋଭାଇସ୍କୋସିଟିର ବୃଦ୍ଧି ପରିଲକ୍ଷିତ ହୁଏ |ଆଶା କରାଯାଏ, LLPS ବ୍ୟତୀତ ଅନ୍ୟ ପରିସ୍ଥିତିରେ ପ୍ରୋଟିନର EPR ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରମ୍ ସଂପୂର୍ଣ୍ଣ ରୂପେ ପୁନ restored ସ୍ଥାପିତ ହୋଇଥିଲା ଯେତେବେଳେ ଏହି ମିଶ୍ରଣରେ 1 M NaCl ଯୋଗ କରାଯାଇଥିଲା (ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 4 ବି) |ସାମଗ୍ରିକ ଭାବରେ, ଆମର ତଥ୍ୟ ସୂଚିତ କରେ ଯେ CW-EPR ଦ୍ det ାରା ଚିହ୍ନଟ ହୋଇଥିବା ପରିବର୍ତ୍ତନଗୁଡ଼ିକ ମୁଖ୍ୟତ the ଘନୀଭୂତ ପର୍ଯ୍ୟାୟରେ ବିଭିନ୍ନ ପଲିକେସନ୍ ସହିତ αS ର C- ଟର୍ମିନାଲ୍ ଅଞ୍ଚଳର ପାରସ୍ପରିକ କାର୍ଯ୍ୟକୁ ପ୍ରତିଫଳିତ କରିଥାଏ ଏବଂ ଏହି ପାରସ୍ପରିକ କ୍ରିୟା ଟାଉ ଅପେକ୍ଷା pLK ସହିତ ଅଧିକ ଶକ୍ତିଶାଳୀ ମନେହୁଏ |
କୋକ୍ରେଭେଟରେ ଥିବା ପ୍ରୋଟିନ୍ ବିଷୟରେ ଅଧିକ ଗଠନମୂଳକ ସୂଚନା ପାଇବାକୁ, ଆମେ ସମାଧାନରେ NMR ବ୍ୟବହାର କରି LLPS ସିଷ୍ଟମ୍ ଅଧ୍ୟୟନ କରିବାକୁ ସ୍ଥିର କଲୁ |ତଥାପି, ଆମେ କେବଳ ବିଚ୍ଛିନ୍ନ ପର୍ଯ୍ୟାୟରେ ଅବଶିଷ୍ଟ αS ଭଗ୍ନାଂଶ ଚିହ୍ନଟ କରିପାରିବା, ଯାହା କୋଏକର୍ଭେଟ୍ ଭିତରେ ଥିବା ପ୍ରୋଟିନ୍ ଗତିଶୀଳତା ଏବଂ NMR ବିଶ୍ଳେଷଣରେ ସମାଧାନର ତଳ ଭାଗରେ ଏକ ଘନ ଚରଣ ହେତୁ ହୋଇପାରେ |ଯେତେବେଳେ ଆମେ NMR (ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଡ଼ିମ୍। 5c, d) ବ୍ୟବହାର କରି LLPS ନମୁନାର ବିଛିନ୍ନ ପର୍ଯ୍ୟାୟରେ ଅବଶିଷ୍ଟ ପ୍ରୋଟିନର ଗଠନ ଏବଂ ଗତିଶୀଳତାକୁ ବିଶ୍ଳେଷଣ କରିଥିଲୁ, ଆମେ ଦେଖିଲୁ ଯେ ଉଭୟ pLK ଏବଂ ΔNt-Tau ଉପସ୍ଥିତିରେ ପ୍ରୋଟିନ୍ ପ୍ରାୟ ସମାନ ଭାବରେ ଆଚରଣ କରିଥିଲା ​​| ଯାହା ଦ୍ secondary ିତୀୟ ଗଠନ ଏବଂ ପ୍ରୋଟିନ୍ ମେରୁଦଣ୍ଡର ଗତିଶୀଳତା ଥିଲା, ଦ୍ secondary ିତୀୟ ରାସାୟନିକ ଶିଫ୍ଟ ଏବଂ R1ρ ଆରାମ ଉପରେ ପରୀକ୍ଷଣ ଦ୍ୱାରା ପ୍ରକାଶିତ |NMR ତଥ୍ୟ ଦର୍ଶାଏ ଯେ αS ର C- ଟର୍ମିନାସ୍ ପଲିସିସନ୍ ସହିତ ଏହାର ପାରସ୍ପରିକ କ୍ରିୟା ହେତୁ ଏହାର ବିଶୃଙ୍ଖଳିତ ପ୍ରକୃତିକୁ ବଜାୟ ରଖିବା ସହିତ କନଫର୍ମେସନ୍ ଫ୍ଲେକ୍ସିବିଲିଟିର ଯଥେଷ୍ଟ କ୍ଷତି ସହିଥାଏ |
ଯେହେତୁ TEMPOL-122-αS ଘନୀଭୂତ ପର୍ଯ୍ୟାୟରେ ଦେଖାଯାଇଥିବା CW-EPR ସିଗନାଲ୍ ବିସ୍ତାର, ପଲିସିସନ୍ ସହିତ ପ୍ରୋଟିନର ପାରସ୍ପରିକ କାର୍ଯ୍ୟକୁ ପ୍ରତିଫଳିତ କରେ, LLPS ଅନୁପସ୍ଥିତିରେ αS ର ବିଭିନ୍ନ ବନ୍ଧନ ସହିତ ବାନ୍ଧୁଥିବା ସମ୍ପର୍କକୁ ଆକଳନ କରିବା ପାଇଁ ଆମେ ଏକ EPR ଟାଇଟ୍ରେସନ୍ କରିଥିଲୁ | ବଫର୍ LLPS), ପରାମର୍ଶ ଦେଇଥାଏ ଯେ ପାରସ୍ପରିକ କ୍ରିୟା ମିଶ୍ରିତ ଏବଂ ଏକାଗ୍ର ପର୍ଯ୍ୟାୟରେ ସମାନ ଅଟେ (ଯାହା ଆମ ତଥ୍ୟ, ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 4a ଏବଂ ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 6 ଦ୍ୱାରା ପ୍ରମାଣିତ) |ଲକ୍ଷ୍ୟ ଥିଲା ସମସ୍ତ କୋକ୍ଭର୍ଭେଟ୍, ସେମାନଙ୍କର ସାଧାରଣ ତରଳ ପରି ଗୁଣ ସତ୍ତ୍ the େ, ମଲିକୁଲାର ସ୍ତରରେ କ under ଣସି ଅନ୍ତର୍ନିହିତ ଭିନ୍ନ ଭିନ୍ନ ଆଚରଣ ପ୍ରଦର୍ଶନ କରନ୍ତି କି ନାହିଁ |ଆଶା କରାଯାଉଥିବା ପରି, ପଲିକେସନ୍ ଏକାଗ୍ରତା ସହିତ EPR ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରମ୍ ବିସ୍ତାର ହେଲା, ସମସ୍ତ ପାରସ୍ପରିକ ଭାଗିଦାରୀର ମଲିକୁଲାର ପାରସ୍ପରିକ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ହେତୁ ମଲିକୁଲାର ନମନୀୟତା ହ୍ରାସକୁ ପ୍ରତିଫଳିତ କଲା (ଚିତ୍ର 3e, ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 6) |tNt-Tau ଏବଂ Tau441 ତୁଳନାରେ pLK ଏକ ନିମ୍ନ ମୋଲାର ଅନୁପାତରେ (polycation: αS) ଏହି ସାଚୁଚରେସନ୍ ହାସଲ କଲା |ବାସ୍ତବରେ, n ସମାନ ଏବଂ ସ୍ independent ାଧୀନ ବନ୍ଧନ ସାଇଟଗୁଡିକ ଅନୁମାନ କରି ଏକ ଆନୁମାନିକ ବାଇଣ୍ଡିଂ ମଡେଲ୍ ସହିତ ତଥ୍ୟର ତୁଳନା ଦର୍ଶାଇଲା ଯେ pLK (~ 5 μM) ର ସ୍ପଷ୍ଟ ବିଚ୍ଛିନ୍ନତା ସ୍ଥିରତା Tau441 କିମ୍ବା ΔNt-Tau (~ 50 μM) ଠାରୁ କମ୍ ପରିମାଣର କ୍ରମ | )µM)ଯଦିଓ ଏହା ଏକ ଆନୁମାନିକ ଆକଳନ, ଏହା ସୂଚିତ କରେ ଯେ କ୍ରମାଗତ ସକରାତ୍ମକ ଚାର୍ଜ ଅଞ୍ଚଳ ସହିତ ସରଳ ପଲିକେସନ୍ ପାଇଁ αS ର ଅଧିକ ସମ୍ପର୍କ ଅଛି |SS ଏବଂ ବିଭିନ୍ନ ପଲିକେସନ୍ ମଧ୍ୟରେ ଥିବା ସମ୍ପର୍କର ଏହି ପାର୍ଥକ୍ୟକୁ ଦେଖି, ଆମେ ଅନୁମାନ କରିଛୁ ଯେ ସେମାନଙ୍କର ତରଳ ଗୁଣଗୁଡ଼ିକ ସମୟ ସହିତ ଭିନ୍ନ ଭାବରେ ବଦଳିପାରେ ଏବଂ ଏହିପରି ବିଭିନ୍ନ LSPT ପ୍ରକ୍ରିୟାରେ ପୀଡିତ |
ପ୍ରୋଟିନ୍ କୋକ୍ରେଭେଟ୍ ଏବଂ ପ୍ରୋଟିନର ଆମିଲଏଡ୍ ପ୍ରକୃତି ମଧ୍ୟରେ ଅତ୍ୟଧିକ ଜନଗହଳିପୂର୍ଣ୍ଣ ପରିବେଶକୁ ଦେଖି, ସମ୍ଭାବ୍ୟ LSPT ପ୍ରକ୍ରିୟାଗୁଡ଼ିକୁ ଚିହ୍ନଟ କରିବା ପାଇଁ ଆମେ ସମୟ ସହିତ କୋକ୍ରେଭେଟର ଆଚରଣକୁ ଦେଖିଲୁ |BF ଏବଂ CF ମାଇକ୍ରୋସ୍କୋପି ବ୍ୟବହାର କରି (ଚିତ୍ର 4), ଆମେ ଦେଖିଲୁ ଯେ αS / Tau441 ବହୁ ପରିମାଣରେ ସମାଧାନରେ ଏକତ୍ରିତ ହୁଏ, ବଡ଼ ବୁନ୍ଦା ଗଠନ କରେ ଯାହା କୂଅର ତଳ ଭାଗରେ ଭୂପୃଷ୍ଠକୁ ଯୋଗାଯୋଗ କରେ ଏବଂ ଓଦା କରେ ଯେପରି ଆଶା କରାଯାଏ (ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଡ଼ିମ୍) । 7d);ଆମେ ଏହି ନିମ୍ନ ଗଠିତ ଗଠନଗୁଡ଼ିକୁ “ପ୍ରୋଟିନ୍ ରାଫ୍ଟସ୍” ବୋଲି କହିଥାଉ |ଏହି ଗଠନଗୁଡ଼ିକ ତରଳ ରହିଲା କାରଣ ସେମାନେ ଫ୍ୟୁଜ୍ କରିବାର କ୍ଷମତା ବଜାୟ ରଖିଥିଲେ (ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଡ଼ିମ୍। 7 ବି) ଏବଂ LLPS ଟ୍ରିଗର ହେବା ପରେ ଅନେକ ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ ଦେଖାଯାଇପାରେ (ଚିତ୍ର 4 ଏବଂ ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 7c) |ଆମେ ଦେଖିଲୁ ଯେ ହାଇଡ୍ରୋଫୋବିକ୍ ସାମଗ୍ରୀ (ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଡ଼ିମ୍। 7a) ଅପେକ୍ଷା ହାଇଡ୍ରୋଫିଲିକ୍ ପୃଷ୍ଠରେ ଓଦା ପ୍ରକ୍ରିୟାକୁ ପସନ୍ଦ କରାଯାଏ, ଅସନ୍ତୁଳିତ ଚାର୍ଜ ସହିତ ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋଷ୍ଟାଟିକ୍ କୋକ୍ରେଭେଟ୍ ପାଇଁ ଆଶା କରାଯାଏ ଏବଂ ଏହିପରି ଉଚ୍ଚ ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋଷ୍ଟାଟିକ୍ ଭୂପୃଷ୍ଠ ସମ୍ଭାବନା |ଉଲ୍ଲେଖଯୋଗ୍ୟ, αS / ΔNt-Tau ସମନ୍ୱୟ ଏବଂ ରାଫ୍ଟିଙ୍ଗ୍ ଯଥେଷ୍ଟ ହ୍ରାସ ପାଇଥିବାବେଳେ αS / pLK କଣ୍ଡେନ୍ସେଟ୍ ଯଥେଷ୍ଟ ହ୍ରାସ ପାଇଲା (ଚିତ୍ର 4) |ସ୍ୱଳ୍ପ ଇନକ୍ୟୁବେସନ ସମୟ ମଧ୍ୟରେ, αS / pLK ବୁନ୍ଦା ହାଇଡ୍ରୋଫିଲିକ୍ ପୃଷ୍ଠକୁ ଏକତ୍ର କରି ଓଦା କରିବାରେ ସକ୍ଷମ ହୋଇଥିଲା, କିନ୍ତୁ ଏହି ପ୍ରକ୍ରିୟା ଶୀଘ୍ର ବନ୍ଦ ହୋଇଗଲା ଏବଂ 5 ଘଣ୍ଟା ଇନକ୍ୟୁବେସନ ପରେ, କେବଳ ସୀମିତ ସମନ୍ୱୟ ଘଟଣା ଏବଂ କ wet ଣସି ଓଦା ପରିଲକ୍ଷିତ ହେଲା ନାହିଁ |- ଜେଲ୍-ଡ୍ରପ୍ ସଂକ୍ରମଣ |
100 µM Tau441 (ଉପର) ଫ୍ଲୋରୋସେନ୍ସ) ମାଇକ୍ରୋସ୍କୋପିକ୍ ପ୍ରତିଛବି ଉପସ୍ଥିତିରେ LLPS ବଫରରେ 100 µM αS (1% ଫ୍ଲୋରୋସେଣ୍ଟ୍ ଲେବଲ୍) ଧାରଣ କରିଥିବା କୋଏକର୍ଭେଟ୍ ନମୁନାଗୁଡିକର ପ୍ରତିନିଧୀ BF (ଗ୍ରୀସ୍କାଲ୍ ପ୍ୟାନେଲ୍) ଏବଂ CF (ଡାହାଣ ପ୍ୟାନେଲ୍, AF488- ଲେବଲ୍ αS) | -କାଉ (କେନ୍ଦ୍ର) କିମ୍ବା m ୦୦ ମିଟର pLK (ତଳ) ବିଭିନ୍ନ ଇନକ୍ୟୁବେସନ ସମୟ ଏବଂ ଫୋକାଲ୍ ଉଚ୍ଚତା (z, ପ୍ଲେଟର ତଳୁ ଦୂରତା) |ସମାନ ଫଳାଫଳ ସହିତ ପରସ୍ପରଠାରୁ ନିରପେକ୍ଷ ଭାବରେ ପରୀକ୍ଷଣଗୁଡିକ 4-6 ଥର ପୁନରାବୃତ୍ତି କରାଯାଇଥିଲା |αS / Tau441 coacervates 24 ଘଣ୍ଟା ପରେ ଓଦା ହୋଇଯାଏ, ପ୍ରତିଛବିଠାରୁ ବଡ଼ ରାଫ୍ଟ ଗଠନ କରେ |ସମସ୍ତ ପ୍ରତିଛବିଗୁଡିକ ପାଇଁ ସ୍କେଲ୍ ବାର୍ ହେଉଛି 20 µm |
ତା’ପରେ ଆମେ ପଚାରିଥିଲୁ αS / Tau441 LLPS ରେ ଗଠିତ ବୃହତ ତରଳ ପରି ପ୍ରୋଟିନ୍ ପୁଲ୍ ଅଧ୍ୟୟନ କରାଯାଇଥିବା କ prot ଣସି ପ୍ରୋଟିନର ଆମିଲଏଡ୍ ଏଗ୍ରିଗେସନ୍ ହେବ କି?ଉପରୋକ୍ତ ସମାନ ଅବସ୍ଥାରେ WF ମାଇକ୍ରୋସ୍କୋପି ସହିତ ସମୟ ସହିତ αS / Tau441 ବୁନ୍ଦା ପରିପକ୍ .ତା ଅନୁସରଣ କଲୁ, କିନ୍ତୁ 1 μM AF488- ଲେବଲ୍ αS ଏବଂ Atto647N- ଲେବଲ୍ Tau441 (ଚିତ୍ର 5a) ବ୍ୟବହାର କରି |ଆଶା କରାଯାଉଥିବା ପରି, ପରିପକ୍ୱତା ପ୍ରକ୍ରିୟାରେ ଆମେ ସମ୍ପୂର୍ଣ୍ଣ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଲୋକାଲାଇଜେସନ୍ ଦେଖିଲୁ |କ Interest ତୁହଳର ବିଷୟ, ca ରୁ5 ଘଣ୍ଟା ପରେ, ରାଫ୍ଟ ଭିତରେ ଅଧିକ ତୀବ୍ର ଅଣ-ବୃତ୍ତାକାର ସଂରଚନା ଦେଖାଗଲା, ଯାହାକୁ ଆମେ “ପଏଣ୍ଟ୍” ବୋଲି କହିଥିଲୁ, ସେଥିମଧ୍ୟରୁ αS ସହିତ କୋଲୋକାଲାଇଜ୍ ହୋଇଥିଲା ଏବଂ କିଛି Tau441 ରେ ଚିତ୍ରିତ ହୋଇଥିଲା (ଚିତ୍ର 5a, ଧଳା ତୀର) |SpS / ΔNt-Tau ଅପେକ୍ଷା αS / ΔNt-Tau ପାଇଁ ଏହି ଦାଗଗୁଡ଼ିକ ସର୍ବଦା ରାଫ୍ଟ ମଧ୍ୟରେ ପାଳନ କରାଯାଇଥାଏ |PLK ଏବଂ Tau ସିଷ୍ଟମର ବୁନ୍ଦାଗୁଡ଼ିକରେ ଫ୍ୟୁଜନ୍ / ୱେଟିଂ ପାଇଁ ଅକ୍ଷମ |SS ଏବଂ Tau441 ଧାରଣ କରିଥିବା ଏହି ଦାଗଗୁଡିକ ଆମିଲଏଡ୍ ପରି ଏଗ୍ରିଗେଟ୍ କି ନାହିଁ ପରୀକ୍ଷା କରିବାକୁ, ଆମେ CF ମାଇକ୍ରୋସ୍କୋପି ବ୍ୟବହାର କରି ସମାନ ପରୀକ୍ଷଣ କରିଥିଲୁ ଯେଉଁଥିରେ Tau441 କୁ Atto647N ଏବଂ 12.5 μM ଆମିଲଏଡ୍-ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ଥିଓଫ୍ଲାଭିନ୍-ଟି (ThT) ଯୋଗ କରାଯାଇଥିଲା |ରଙ୍ଗଯଦିଓ hS / Tau441 ବୁନ୍ଦା କିମ୍ବା ରାଫ୍ଟର ThT- ଦାଗ 24 ଘଣ୍ଟା ଇନକ୍ୟୁବେସନ ପରେ ମଧ୍ୟ ଦେଖାଗଲା ନାହିଁ (ଚିତ୍ର 5 ବି, ଉପର ଧାଡି - ପ୍ରୋଟିନ୍ ରାଫ୍ଟ ଉପରେ ଅବଶିଷ୍ଟ ଡ୍ରପଲେଟ୍), ରାଫ୍ଟ ଭିତରେ Atto647N-Tau441 ଧାରଣ କରିଥିବା ThT- ପଜିଟିଭ୍ ଗଠନ ବହୁତ ଦୁର୍ବଳ ଥିଲା |ଏହା ପୂର୍ବରୁ ବର୍ଣ୍ଣିତ ଦାଗଗୁଡ଼ିକର ଆକାର, ଆକୃତି ଏବଂ ଅବସ୍ଥାନର ନକଲ କରିଥାଏ (ଚିତ୍ର 5 ବି, ମଧ୍ୟମ ଏବଂ ତଳ ଧାଡି), ପରାମର୍ଶ ଦେଇଥାଏ ଯେ ଦାଗଗୁଡ଼ିକ ବାର୍ଦ୍ଧକ୍ୟ ତରଳ କୋଏକର୍ଭେଟରେ ସୃଷ୍ଟି ହୋଇଥିବା ଆମିଲଏଡ୍ ପରି ଏଗ୍ରିଗେଟ୍ ସହିତ ଅନୁରୂପ ହୋଇପାରେ |
ବିଭିନ୍ନ ଇନକ୍ୟୁବେସନ ସମୟରେ WF 25 μM αS ଏବଂ LLPS ବଫର୍ ସହିତ ଏକ ମାଇକ୍ରୋସ୍କୋପ୍ ପ୍ଲେଟର କୂଅରେ 25 μM Tau441 (1 μM AF488- ଲେବଲ୍ αS ଏବଂ Atto647N- ନାମିତ Tau441) ର ଉପସ୍ଥିତିରେ ଫୋକାଲ୍ ଉଚ୍ଚତା (z, ସୀମା ତଳରୁ ଦୂରତା) | ।ସମାନ ଫଳାଫଳ ସହିତ Six ଟି ପରୀକ୍ଷଣ ସ୍ ently ାଧୀନ ଭାବରେ ପୁନରାବୃତ୍ତି କରାଯାଇଥିଲା |25 μM Tau441 (1 μM Atto647N- ନାମିତ Tau441) ଏବଂ 12.5 μM ଥିଓଫ୍ଲାଭିନ୍-ଟି (ThT) ର ଉପସ୍ଥିତିରେ 25 μM αS ର CF ମାଇକ୍ରୋସ୍କୋପିକ୍ ପ୍ରତିଛବି |ଓଜନ ବିଶିଷ୍ଟ ପ୍ରୋଟିନ୍ ବୁନ୍ଦା ଏବଂ ଜମା ହୋଇଥିବା ପ୍ରୋଟିନ୍ ରାଫ୍ଟ ଏବଂ ଦାଗ ଯଥାକ୍ରମେ ଉପର ଏବଂ ମଧ୍ୟମ ଧାଡିରେ ଦେଖାଯାଏ |ତଳ ଧାଡିରେ 3 ଟି ସ୍ independent ାଧୀନ ପ୍ରତିକୃତିରୁ ରାଫ୍ଟ ଏବଂ ଡ୍ରପ୍ ର ଚିତ୍ର ଦେଖାଯାଏ |ଧଳା ତୀରଗୁଡ଼ିକ ଉଭୟ ପ୍ୟାନେଲରେ ThT- ପଜିଟିଭ୍ ବିନ୍ଦୁଗୁଡ଼ିକୁ ସୂଚିତ କରେ |ସମସ୍ତ ପ୍ରତିଛବିଗୁଡିକ ପାଇଁ ସ୍କେଲ୍ ବାର୍ ହେଉଛି 20 µm |
ତରଳରୁ କଠିନକୁ ପରିବର୍ତ୍ତନ ସମୟରେ କୋଏକର୍ଭେଟ୍ ପ୍ରୋଟିନ୍ ନେଟୱାର୍କର ପରିବର୍ତ୍ତନଗୁଡିକ ବିଷୟରେ ଅଧିକ ବିସ୍ତୃତ ଭାବରେ ପରୀକ୍ଷା କରିବାକୁ, ଆମେ ଫ୍ଲୋରୋସେନ୍ସ ଆଜୀବନ ଇମେଜିଙ୍ଗ୍ (FLIM) ଏବଂ ଫର୍ଷ୍ଟର୍ ରିଜୋନାନ୍ସ ଶକ୍ତି ସ୍ଥାନାନ୍ତର ମାଇକ୍ରୋସ୍କୋପି (FRET) (ଚିତ୍ର 6 ଏବଂ ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 8 ଏବଂ 9) ବ୍ୟବହାର କରିଥିଲୁ |ଆମେ ଅନୁମାନ କରିଛୁ ଯେ ସ୍ତରର କୋଏକର୍ଭେଟ୍ ପରିପକ୍ .ତା ଅଧିକ ଘନୀଭୂତ କିମ୍ବା ଏପରିକି କଠିନ ପରି ଏକୀକୃତ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଗଠନରେ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଏବଂ ଏଥିରେ ଲାଗିଥିବା ଫ୍ଲୋରୋସେଣ୍ଟ୍ ପ୍ରୋବ ମଧ୍ୟରେ ଘନିଷ୍ଠ ସମ୍ପର୍କ ସୃଷ୍ଟି କରିଥାଏ, ସମ୍ଭବତ a ଏକ କ୍ଷୁଦ୍ର ଅନୁସନ୍ଧାନ ଜୀବନ (τ) ରେ ପ୍ରଦର୍ଶିତ ଏକ ଲିଭାଇବା ପ୍ରଭାବ ସୃଷ୍ଟି କରିଥାଏ | , ପୂର୍ବରୁ ବର୍ଣ୍ଣନା କରାଯାଇଥିବା ପରି, 41, 42ଏହା ସହିତ, ଡବଲ୍ ଲେବଲ୍ ହୋଇଥିବା ନମୁନା ପାଇଁ (AF488 ଏବଂ Atto647N ଯଥାକ୍ରମେ FRET ଦାତା ଏବଂ ଗ୍ରହଣକାରୀ ରଙ୍ଗ ଭାବରେ), τ ର ଏହି ହ୍ରାସ କୋଏକର୍ଭେଟ୍ କଣ୍ଡେନ୍ସେସ୍ ଏବଂ LSPT ସମୟରେ FRET (E) ଦକ୍ଷତା ବୃଦ୍ଧି ସହିତ ମଧ୍ୟ ହୋଇପାରେ |ଆମେ LLPS αS / Tau441 ଏବଂ αS / ΔNt-Tau ନମୁନାରେ ସମୟ ସହିତ ରାଫ୍ଟ ଏବଂ ସ୍ପଟ୍ ଗଠନ ଉପରେ ନଜର ରଖିଥିଲୁ (LLPS ବଫର୍ରେ ପ୍ରତ୍ୟେକ ପ୍ରୋଟିନ୍ ର 25 µM αS ଏବଂ / କିମ୍ବା Atto647N ନାମକ Tau441 କିମ୍ବା ΔNt-Tau) |ଆମେ ଏକ ସାଧାରଣ ଧାରାକୁ ଦେଖିଲୁ ଯେ AF488 (τ488) ଏବଂ Atto647N (τ647N) ପ୍ରୋବ୍ର ଫ୍ଲୋରୋସେନ୍ସ ଜୀବନକାଳ ସାମାନ୍ୟ ହ୍ରାସ ପାଇଲା ଯେହେତୁ କୋଏକର୍ଭେଟ୍ ପରିପକ୍ୱ ହେଲା (ଚିତ୍ର 6 ଏବଂ ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 8c) |କ Interest ତୁହଳର ବିଷୟ, ଏହି ପରିବର୍ତ୍ତନ ରାଫ୍ଟ ମଧ୍ୟରେ ଥିବା ବିନ୍ଦୁଗୁଡ଼ିକ ପାଇଁ ଯଥେଷ୍ଟ ବୃଦ୍ଧି କରାଯାଇଥିଲା (ଚିତ୍ର 6c), ସୂଚାଇଥାଏ ଯେ ବିନ୍ଦୁରେ ଅଧିକ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଘନୀଭୂତ ହୋଇଛି |ଏହାକୁ ସମର୍ଥନ କରି, 24 ଘଣ୍ଟା (ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଡ଼ିମ୍। 8d) ପାଇଁ αS / tNt-Tau ବୁନ୍ଦା ପାଇଁ ଫ୍ଲୋରୋସେନ୍ସ ଜୀବନକାଳରେ କ significant ଣସି ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ପରିବର୍ତ୍ତନ ପରିଲକ୍ଷିତ ହୋଇନଥିଲା, ଏହା ଦର୍ଶାଏ ଯେ ଡ୍ରପଲେଟ୍ ଜେଲେସନ୍ ଚିହ୍ନିବା ଠାରୁ ଭିନ୍ନ ଏକ ପ୍ରକ୍ରିୟା ଏବଂ ଏହା ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ମଲିକୁଲାର ପୁନର୍ଗଠନ ସହିତ ଆସେ ନାହିଁ | coacervates ଭିତରେ |ଏହା ମନେ ରଖିବା ଉଚିତ ଯେ ବିନ୍ଦୁଗୁଡ଼ିକରେ differentS ରେ ଭିନ୍ନ ଆକାର ଏବଂ ପରିବର୍ତ୍ତନଶୀଳ ବିଷୟବସ୍ତୁ ଥାଏ, ବିଶେଷତ α αS / Tau441 ସିଷ୍ଟମ୍ (ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 8e) ପାଇଁ |ସ୍ପଟ୍ ଫ୍ଲୋରୋସେନ୍ସ ଜୀବନକାଳର ହ୍ରାସ ତୀବ୍ରତାର ବୃଦ୍ଧି ସହିତ ହୋଇଥିଲା, ବିଶେଷତ Ta Tau441 (ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 8a) ନାମକ Atto647N ପାଇଁ, ଏବଂ ଉଭୟ αS / Tau441 ଏବଂ αS / ΔNt-Tau ସିଷ୍ଟମ୍ ପାଇଁ ଅଧିକ FRET ଦକ୍ଷତା, LLPS ପାଞ୍ଚ ଘଣ୍ଟାରେ ଅଧିକ ଘନୀଭୂତ ସୂଚାଇଥାଏ | ଟ୍ରିଗର କରିବା ପରେ, ଷ୍ଟାଟିକ୍ ବିଦ୍ୟୁତ୍ ଭିତରେ ଥିବା ପ୍ରୋଟିନ୍ଗୁଡ଼ିକ ଘନୀଭୂତ ହେଲା |SS / tNt-Tau ତୁଳନାରେ, ଆମେ lowerS / Tau441 ସ୍ପଟ୍ ଗୁଡିକରେ ନିମ୍ନ τ647N ଏବଂ କିଛି ଅଧିକ ଉଚ୍ଚ τ488 ମୂଲ୍ୟ ଦେଖିଲୁ, ନିମ୍ନ ଏବଂ ଅଧିକ ଅମାନୁଷିକ FRET ମୂଲ୍ୟ ସହିତ |ସମ୍ଭବତ ,, ଏହା ସତ୍ୟ ସହିତ ଜଡିତ ହୋଇପାରେ ଯେ αS / Tau441 ସିଷ୍ଟମରେ, ଏଗ୍ରିଗେଟଗୁଡିକରେ ଦେଖାଯାଇଥିବା ଏବଂ ଆଶା କରାଯାଉଥିବା αS ପ୍ରଚୁରତା ଟାଉ ତୁଳନାରେ ଅଧିକ ହେଟ୍ରୋଜେନିସ୍, ପ୍ରାୟତ sub ସବଷ୍ଟୋଚିଓମେଟ୍ରିକ୍, କାରଣ Tau441 ନିଜେ LLPS ଏବଂ ଏକୀକରଣ ମଧ୍ୟ ଦେଇପାରେ (ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 8e) | ।ଅବଶ୍ୟ, ଡ୍ରପଲେଟ୍ କୋଏଲେସେନ୍ସର ଡିଗ୍ରୀ, ରାଫ୍ଟ ଗଠନ, ଏବଂ ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ କଥା ହେଉଛି, ଉଭୟ Tau441 ଏବଂ αS ଉପସ୍ଥିତ ଥିବାବେଳେ ତରଳ ପରି କୋଏକର୍ଭେଟ୍ ମଧ୍ୟରେ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଏକୀକରଣ ସର୍ବାଧିକ |
ପ୍ରତ୍ୟେକ ପ୍ରୋଟିନ୍ ର 25 μM ରେ αS / Tau441 ଏବଂ αS / ΔNt-Tau ର ଏକ ଲାଇଫ୍ ଟାଇମ୍ ଫ୍ଲୋରୋସେନ୍ସ ମାଇକ୍ରୋସ୍କୋପି (FLIM) ପ୍ରତିଛବି LLPS ବଫରରେ |ସ୍ତମ୍ଭଗୁଡ଼ିକ ବିଭିନ୍ନ ପରିପକ୍ୱତା ସମୟରେ (30 ମିନିଟ୍, 5 ଘଣ୍ଟା ଏବଂ 24 ଘଣ୍ଟା) LLPS ନମୁନାଗୁଡିକର ପ୍ରତିନିଧୀ ଚିତ୍ର ଦେଖାଏ |ଲାଲ୍ ଫ୍ରେମ୍ αS / Tau441 ସ୍ପଟ୍ ଧାରଣ କରିଥିବା ଅଞ୍ଚଳକୁ ଦର୍ଶାଏ |ଲାଇଫ୍ ସ୍ପାନ୍ ରଙ୍ଗ ବାର୍ ଭାବରେ ଦେଖାଯାଏ |ସମସ୍ତ ପ୍ରତିଛବି ପାଇଁ ମାପ ଦଣ୍ଡ = 20 µm |b ମନୋନୀତ କ୍ଷେତ୍ରର ଜୁମ୍-ଇନ୍ FLIM ପ୍ରତିଛବି, ପ୍ୟାନେଲରେ ଥିବା ଲାଲ୍ ବାକ୍ସରେ ପ୍ରଦର୍ଶିତ |ପ୍ୟାନେଲ୍ a ପରି ସମାନ ରଙ୍ଗ ସ୍କେଲ୍ ବ୍ୟବହାର କରି ଲାଇଫ୍ ରେଞ୍ଜ୍ ଦେଖାଯାଏ |ମାପ ଦଣ୍ଡ = 5 µ ମି।c ବିଭିନ୍ନ ପ୍ରୋଗ୍ରାମ ପ୍ରଜାତି (ଡ୍ରପଲେଟ୍-ଡି-, ରାଫ୍ଟ-ଆର- ଏବଂ ଦାଗ- P) ପାଇଁ AF488 (αS ସହିତ ସଂଲଗ୍ନ) କିମ୍ବା Atto647N (ଟାଉ ସହିତ ସଂଲଗ୍ନ) ହିଷ୍ଟୋଗ୍ରାମ୍ Tau441 ର ସମୟ ବଣ୍ଟନ ଜୀବନକାଳ ମଧ୍ୟରେ FLIM ପ୍ରତିଛବିରେ ଚିହ୍ନିତ | αS / tNt-Tau coacervate ନମୁନା (D ପାଇଁ N = 17-32 ROI, R ପାଇଁ 29-44 ROI, ଏବଂ ପଏଣ୍ଟ ପାଇଁ 21-51 ROI) |ହାରାହାରି ଏବଂ ମଧ୍ୟମ ମୂଲ୍ୟଗୁଡ଼ିକ ଯଥାକ୍ରମେ ବାକ୍ସ ଭିତରେ ହଳଦିଆ ବର୍ଗ ଏବଂ କଳା ରେଖା ଭାବରେ ଦେଖାଯାଏ |ବାକ୍ସର ନିମ୍ନ ଏବଂ ଉପର ସୀମା ଯଥାକ୍ରମେ ପ୍ରଥମ ଏବଂ ତୃତୀୟ ଚତୁର୍ଥାଂଶକୁ ପ୍ରତିନିଧିତ୍। କରେ, ଏବଂ 1.5-ଗୁଣା ଆନ୍ତ qu ବିଭାଗ ପରିସର (IQR) ମଧ୍ୟରେ ସର୍ବନିମ୍ନ ଏବଂ ସର୍ବାଧିକ ମୂଲ୍ୟଗୁଡିକ ଚକ୍କର ଭାବରେ ଦେଖାଯାଏ |ଆଉଟଲିଅର୍ ଗୁଡିକ କଳା ହୀରା ଭାବରେ ଦେଖାଯାଏ |ଯୁଗଳ ବଣ୍ଟନ ମଧ୍ୟରେ ପରିସଂଖ୍ୟାନିକ ମହତ୍ତ୍ two ଅସମାନ ଭିନ୍ନତାକୁ ଅନୁମାନ କରି ଦୁଇ-ନମୁନା ଟି-ଟେଷ୍ଟ ବ୍ୟବହାର କରି ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରାଯାଇଥିଲା |ଦୁଇ-ଲାଞ୍ଜ ବିଶିଷ୍ଟ ଟି-ଟେଷ୍ଟ p- ମୂଲ୍ୟଗୁଡ଼ିକ ତୁଳନାତ୍ମକ ତଥ୍ୟର ପ୍ରତ୍ୟେକ ଯୋଡି ପାଇଁ ଆଷ୍ଟେରିସ୍କ ସହିତ ଦେଖାଯାଏ (* p-value> 0.01, ** p-value> 0.001, *** p-value> 0.0001, **** p-value> 0.00001), ns ଅବହେଳାକୁ ସୂଚାଏ (p-value> 0.05) |ସଠିକ୍ p ମୂଲ୍ୟଗୁଡ଼ିକ ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଟେବୁଲ୍ 1 ରେ ଦିଆଯାଇଛି, ଏବଂ ମୂଳ ତଥ୍ୟ କଞ୍ଚା ଡାଟା ଫାଇଲ୍ ଭାବରେ ଉପସ୍ଥାପିତ ହୋଇଛି |
ସ୍ପେକ୍ଲେସ୍ / ଏଗ୍ରିଗେଟ୍ସର ଆମିଲଏଡ୍ ପରି ପ୍ରକୃତିକୁ ଅଧିକ ପ୍ରଦର୍ଶନ କରିବାକୁ, ଆମେ (1 M) NaCl ର ଏକାଗ୍ରତା ସହିତ 24 ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ ଅପରିଷ୍କୃତ କୋକ୍ରେଭେଟ୍ ନମୁନାକୁ ଚିକିତ୍ସା କରିଥିଲୁ, ଯାହା ଫଳସ୍ୱରୂପ ପ୍ରୋଟିନ୍ କୋକର୍ଭେଟସ୍ ଠାରୁ ଏଗ୍ରିଗେଟ୍ ଗୁଡିକ ପୃଥକ ହୋଇଗଲା |ଯେତେବେଳେ ପରମାଣୁ ଶକ୍ତି ମାଇକ୍ରୋସ୍କୋପି (AFM) ବ୍ୟବହାର କରି ବିଚ୍ଛିନ୍ନ ଏଗ୍ରିଗେଟ୍ସ (ଅର୍ଥାତ୍ ଏଗ୍ରିଗେଟ୍ସର ଏକ ବିସ୍ତୃତ ସମାଧାନ) ଦେଖାଗଲା, ଆମେ ପ୍ରାୟ 15 nm ଉଚ୍ଚତାର ନିୟମିତ ଉଚ୍ଚତା ବିଶିଷ୍ଟ ଏକ ଗୋଲାକାର ମର୍ଫୋଲୋଜି ଦେଖିଲୁ, ଯାହା ଉଚ୍ଚ ଲୁଣର ଏକାଗ୍ରତା ଅବସ୍ଥାରେ ଜଡିତ ହେବାକୁ ଲାଗେ | ଭୂପୃଷ୍ଠରେ ଶକ୍ତିଶାଳୀ ହାଇଡ୍ରୋଫୋବିକ୍ ପ୍ରଭାବ ହେତୁ ସାଧାରଣ ଆମିଲଏଡ୍ ଫାଇବ୍ରିଲଗୁଡିକର ଆଚରଣ (ଧ୍ୟାନ ଦିଅନ୍ତୁ ଯେ ଫାଇବ୍ରିଲଗୁଡିକର ଉଚ୍ଚତା ~ 10 nm) (ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 10a) |କ Interest ତୁହଳର ବିଷୟ, ଯେତେବେଳେ ଏକ ଷ୍ଟାଣ୍ଡାର୍ଡ ThT ଫ୍ଲୋରୋସେନ୍ସ ଆସେରେ ThT ସହିତ ବିଚ୍ଛିନ୍ନ ଏଗ୍ରିଗେଟ୍ ଗୁଡିକ ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତ କରାଯାଇଥିଲା, ଆମେ ThT ଫ୍ଲୋରୋସେନ୍ସ କ୍ୱାଣ୍ଟମ୍ ଅମଳର ନାଟକୀୟ ବୃଦ୍ଧି ଦେଖିଲୁ, ଯାହା ତୁଳନାତ୍ମକ ଭାବରେ ଯେତେବେଳେ ସାଧାରଣ αS ଆମିଲଏଡ୍ ଫାଇବ୍ରିଲ୍ (ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 10b) ସହିତ ଇନ୍କ୍ୟୁବ୍ କରାଯାଇଥିଲା | କୋକର୍ଭେଟ୍ ଏଗ୍ରିଗେଟ୍ ଗୁଡିକରେ ଆମିଲଏଡ୍ ପରି ଗଠନ ଥାଏ |।ବାସ୍ତବରେ, ଏଗ୍ରିଗେଟ୍ ଗୁଡିକ ଅଧିକ ଲୁଣର ଏକାଗ୍ରତା ପାଇଁ ସହନଶୀଳ ଥିଲେ କିନ୍ତୁ ସାଧାରଣ ଆମିଲଏଡ୍ ଫାଇବ୍ରିଲ୍ (ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 10c) ପରି 4 ମି ଗୁଆନାଡାଇନ୍ କ୍ଲୋରାଇଡ୍ (GdnHCl) ପ୍ରତି ସମ୍ବେଦନଶୀଳ |
ପରବର୍ତ୍ତୀ ସମୟରେ, ଆମେ ଏକକ ଅଣୁଗୁଡ଼ିକର ଫ୍ଲୋରୋସେନ୍ସ, ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ଫ୍ଲୋରୋସେନ୍ସ କୋରିଆଲେସନ୍ / କ୍ରସ୍-କୋରିଆଲେସନ୍ ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରସ୍କୋପି (FCS / FCCS) ବ୍ୟବହାର କରି ଏଗ୍ରିଗେଟଗୁଡିକର ରଚନା ବିଶ୍ଳେଷଣ କରିଥିଲୁ ଏବଂ ଦୁଇ ରଙ୍ଗର ସମକକ୍ଷ ଚିହ୍ନଟ (TCCD) ର ବିସ୍ଫୋରଣ ବିଶ୍ଳେଷଣ କରିଥିଲୁ |ଏହି ଉଦ୍ଦେଶ୍ୟରେ, ଆମେ μS ଏବଂ Tau441 (ଉଭୟ 25 μM) ଧାରଣ କରିଥିବା 100 μl LLPS ନମୁନାରେ 24 ଘଣ୍ଟା ଇନକ୍ୟୁବେସନ ପରେ ଗଠିତ ଏଗ୍ରିଗେଟ୍ଗୁଡ଼ିକୁ ପୃଥକ କରି 1 μM AF488- ଲେବଲ୍ αS ଏବଂ 1 μM Atto647N- ଲେବଲ୍ Tau441 |ସମାନ PEG- ମୁକ୍ତ ବଫର୍ ଏବଂ 1 M NaCl (ସମାନ ବଫର୍ କୋକ୍ରେଭେଟରୁ ଏଗ୍ରିଗେଟ୍ଗୁଡ଼ିକୁ ପୃଥକ କରିବା ପାଇଁ ବ୍ୟବହୃତ ସମାନ ବଫର୍) ବ୍ୟବହାର କରି ଏକ ବିସ୍ତୃତ ଏକକ ସମାଧାନକୁ LLPS ଏବଂ ପ୍ରୋଟିନ୍ ମଧ୍ୟରେ କ possible ଣସି ସମ୍ଭାବ୍ୟ ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋଷ୍ଟାଟିକ୍ ପାରସ୍ପରିକ କାର୍ଯ୍ୟକୁ ରୋକିବା ପାଇଁ ମିଶ୍ରିତ କରନ୍ତୁ |ଗୋଟିଏ ଅଣୁର ସମୟ ଟ୍ରାଜେକ୍ଟୋରୀର ଏକ ଉଦାହରଣ ଚିତ୍ର 7a ରେ ଦେଖାଯାଇପାରେ |FCCS / FCS ବିଶ୍ଳେଷଣ (କ୍ରସ୍-କୋରିଆଲେସନ୍, CC ଏବଂ ଅଟୋକୋରେଲେସନ୍, ଏସି) ଦର୍ଶାଇଲା ଯେ ନମୁନାରେ αS ଏବଂ ta ଧାରଣ କରିଥିବା ଏଗ୍ରିଗେଟ୍ ଗୁଡିକ ପ୍ରଚୁର ଥିଲା (ଚିତ୍ର 7 ବି, ବାମ ପ୍ୟାନେଲରେ CC ବକ୍ର ଦେଖନ୍ତୁ), ଏବଂ ଅବଶିଷ୍ଟ ମୋନୋମେରିକ୍ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଏକ ଅତିରିକ୍ତ ଭାବରେ ସୃଷ୍ଟି ହେଲା | ମିଶ୍ରଣ ପ୍ରକ୍ରିୟାର ଫଳାଫଳ (ଚିତ୍ର 7b, ବାମ ପ୍ୟାନେଲରେ AC ବକ୍ରଗୁଡିକ ଦେଖନ୍ତୁ) |ସମାନ ସମାଧାନ ଅବସ୍ଥାରେ କରାଯାଇଥିବା ନିୟନ୍ତ୍ରଣ ପରୀକ୍ଷଣଗୁଡିକ କେବଳ ମୋନୋମେରିକ୍ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଧାରଣ କରିଥିବା ନମୁନାଗୁଡିକ ବ୍ୟବହାର କରି କ C ଣସି CC ବକ୍ରତା ଦେଖାଇଲା ନାହିଁ, ଏବଂ ଏସି ବକ୍ରଗୁଡିକ ଏକ-ଉପାଦାନ ବିସ୍ତାର ମଡେଲ (ଇକ। 4) ସହିତ ଭଲ ଭାବରେ ଫିଟ୍ ହୁଏ, ଯେଉଁଠାରେ ମୋନୋମେରିକ୍ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଗୁଡିକ ଆଶା କରାଯାଉଥିବା ବିସ୍ତାର କୋଏଫେସିଏଣ୍ଟସ୍ (ଚିତ୍ର 7b) | ), ଡାହାଣ ପ୍ୟାନେଲ୍) |ଏକତ୍ରିତ କଣିକାର ବିସ୍ତାର କୋଏଫିସିଣ୍ଟେଣ୍ଟ 1 µm2 / s ରୁ କମ୍, ଏବଂ ମୋନୋମେରିକ୍ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଗୁଡିକ ପ୍ରାୟ 1 µm2 / s ଅଟେ |50–100 µm / s;ସମାନ ସମାଧାନ ଅବସ୍ଥାରେ ସୋନିକେଟ୍ αS ଆମିଲଏଡ୍ ଫାଇବ୍ରିଲ୍ ଏବଂ ମୋନୋମେରିକ୍ αS ପାଇଁ ମୂଲ୍ୟଗୁଡ଼ିକ ପୂର୍ବରୁ ପ୍ରକାଶିତ ମୂଲ୍ୟ ସହିତ ସମାନ |ଯେତେବେଳେ ଆମେ TCCD ବିସ୍ଫୋରଣ ବିଶ୍ଳେଷଣ (ଚିତ୍ର 7c, ଟପ୍ ପ୍ୟାନେଲ୍) ସହିତ ଏଗ୍ରିଗେଟ୍ ଗୁଡିକୁ ବିଶ୍ଳେଷଣ କଲୁ, ଆମେ ଜାଣିଲୁ ଯେ ପ୍ରତ୍ୟେକ ବିଚ୍ଛିନ୍ନ ଏଗ୍ରିଗେଟ୍ (αS / Tau heteroaggregate) ରେ, ଚିହ୍ନଟ ହୋଇଥିବା ଏଗ୍ରିଗେଟଗୁଡିକର ପ୍ରାୟ 60% ଉଭୟ αS ଏବଂ ta ଧାରଣ କରିଥିଲା, ପ୍ରାୟ 30% କେବଳ ଧାରଣ କରିଥିଲା ​​| tau, ପ୍ରାୟ 10% αS କେବଳ |SS / Tau heteroaggregates ର ଷ୍ଟୋଇଚିଓମେଟ୍ରିକ୍ ବିଶ୍ଳେଷଣରୁ ଜଣାପଡିଛି ଯେ ଅଧିକାଂଶ ହେଟେରୋଗ୍ରେଗେଟ୍ ଗୁଡିକ ଟାଉରେ ସମୃଦ୍ଧ ହୋଇଥିଲେ (ଷ୍ଟୋଇଚିଓମେଟ୍ରୀ 0.5। Below ରୁ କମ୍, ଏଗ୍ରିଗେଟ୍ ପ୍ରତି ଟାଉ ଅଣୁଗୁଡ଼ିକର ହାରାହାରି ସଂଖ୍ୟା αS ଅଣୁଠାରୁ 4 ଗୁଣ ଅଧିକ), ଯାହା ଆମ ସ୍ଥିତିରେ FLIM ରେ ଦେଖାଯାଇଥିବା କାର୍ଯ୍ୟ ସହିତ ସମାନ ଅଟେ | ପରୀକ୍ଷଣ |।FRET ବିଶ୍ଳେଷଣ ଦର୍ଶାଇଲା ଯେ ଏହି ଏଗ୍ରିଗେଟ୍ ଗୁଡିକରେ ଉଭୟ ପ୍ରୋଟିନ୍ ରହିଥିଲା, ଯଦିଓ ଏହି କ୍ଷେତ୍ରରେ ପ୍ରକୃତ FRET ମୂଲ୍ୟଗୁଡ଼ିକ ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ନୁହେଁ, ଯେହେତୁ ପରୀକ୍ଷଣରେ ବ୍ୟବହୃତ ଅନାବଶ୍ୟକ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଅଧିକ ହେତୁ ପ୍ରତ୍ୟେକ ଏଗ୍ରିଗେଟରେ ଫ୍ଲୋରୋଫୋର ବଣ୍ଟନ ଅନିୟମିତତା ଥିଲା |କ Interest ତୁହଳର ବିଷୟ, ଯେତେବେଳେ ଆମେ 45,46 ପରିପକ୍ୱ ଆମିଲଏଡ୍ ଏଗ୍ରିଗେସନ୍-ଅଭାବୀ ଟାଉ ପ୍ରକାର ବ୍ୟବହାର କରି ସମାନ ବିଶ୍ଳେଷଣ କରିଥିଲୁ (ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 11a, b ଦେଖନ୍ତୁ), ଆମେ ଲକ୍ଷ୍ୟ କରିଥିଲୁ ଯଦିଓ αS ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋଷ୍ଟାଟିକ୍ ଏଗ୍ରିଗେସନ୍ ସମାନ ଥିଲା (ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 11c, d), କୋଏକର୍ଭେଟ୍ ମଧ୍ୟରେ ଏଗ୍ରିଗେଟ୍ ଗଠନ କରିବାର କ୍ଷମତା ଅତ୍ୟଧିକ ହ୍ରାସ ପାଇଲା ଏବଂ FLIM ସେଟୁ ପରୀକ୍ଷଣରେ ଅନେକ ଦାଗ ଚିହ୍ନଟ କଲା, ଏବଂ ପୃଥକ ଏଗ୍ରିଗେଟ୍ ନମୁନା ପାଇଁ ଦୁର୍ବଳ କ୍ରସ୍-କୋରିଆଲେସନ୍ ବକ୍ରଗୁଡିକ ଦେଖାଗଲା |ତଥାପି, ଅଳ୍ପ ସଂଖ୍ୟକ ଚିହ୍ନଟ ଏଗ୍ରିଗେଟ୍ ପାଇଁ (Tau441 ର କେବଳ ଏକ ଦଶମାଂଶ), ଆମେ ଦେଖିଲୁ ଯେ ପ୍ରତ୍ୟେକ ଏଗ୍ରିଗେଟ୍ ଏହି Tau ପ୍ରକାର ଅପେକ୍ଷା αS ରେ ସମୃଦ୍ଧ ହୋଇଛି, ପ୍ରାୟ 50% ଚିହ୍ନଟ ଏଗ୍ରିଗେଟ୍ ସହିତ କେବଳ αS ଅଣୁ ରହିଥାଏ, ଏବଂ αS ଅତ୍ୟଧିକ ହେଟ୍ରୋଜେନିସ୍ ଥିଲା | ।Tau441 (ଚିତ୍ର 6f) ଦ୍ୱାରା ଉତ୍ପନ୍ନ ହେଟେରୋଜିନସ୍ ଏଗ୍ରିଗେଟ୍ ତୁଳନାରେ, ଏଗ୍ରିଗେଟ୍ସ (ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 11e ଦେଖନ୍ତୁ) |ଏହି ପରୀକ୍ଷଣଗୁଡିକର ଫଳାଫଳ ଦର୍ଶାଇଲା ଯେ ଯଦିଓ αS ନିଜେ କୋଏକର୍ଭେଟ୍ ମଧ୍ୟରେ ଟାଉ ସହିତ ଜମା କରିବାରେ ସକ୍ଷମ, ଏହି ପରିସ୍ଥିତିରେ ଟାଉ ନ୍ୟୁକ୍ଲିୟେସନ୍ ଅଧିକ ଅନୁକୂଳ ଅଟେ ଏବଂ ଫଳସ୍ୱରୂପ ଆମିଲଏଡ୍ ପରି ଏଗ୍ରିଗେଟ୍ ଗୁଡିକ αS ଏବଂ tau ରୂପରେ କାର୍ଯ୍ୟ କରିବାକୁ ସକ୍ଷମ |ଅବଶ୍ୟ, ଥରେ ଏକ ଟାଉ-ରିଚ୍ କୋର୍ ଗଠନ ହୋଇଗଲେ, αS ଏବଂ tau ମଧ୍ୟରେ ହେଟେରୋଟାଇପ୍ ପାରସ୍ପରିକ କ୍ରିୟା ଟାଉ ଅଣୁଗୁଡ଼ିକ ମଧ୍ୟରେ ହୋମୋଟାଇପିକ୍ ପାରସ୍ପରିକ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ଉପରେ ଏଗ୍ରିଗେଟରେ ପସନ୍ଦ କରାଯାଏ |ଆମେ ତରଳ αS / tau coacervates ରେ ପ୍ରୋଟିନ୍ ନେଟୱାର୍କ ମଧ୍ୟ ପାଳନ କରୁ |
αS / Tau441 ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋଷ୍ଟାଟିକ୍ କୋକ୍ରେଭେଟ୍ସରେ ଗଠିତ ବିଚ୍ଛିନ୍ନ ଏଗ୍ରିଗେଟଗୁଡିକର ଏକକ ଅଣୁଗୁଡ଼ିକର ଏକ ପ୍ରତିନିଧୀ ଫ୍ଲୋରୋସେନ୍ସ ସାମୟିକ ଚିହ୍ନ |ତିନୋଟି ଚିହ୍ନଟ ଚ୍ୟାନେଲରେ (AF488 ଏବଂ Atto647N ନିର୍ଗମନ ପରେ ପ୍ରତ୍ୟକ୍ଷ ଉତ୍ତେଜନା, ନୀଳ ଏବଂ ନାଲି ରେଖା, ପରୋକ୍ଷ ଉତ୍ତେଜନା ପରେ Atto647N ନିର୍ଗମନ), FRET, ବାଇଗଣୀ ରେଖା) αS / Tau441 କୋଏଗ୍ରେଗେଟ୍ସ ସହିତ ଥିବା ବିସ୍ଫୋରଣଗୁଡିକ (ସୂଚିତ ସୀମାଠାରୁ ଅଧିକ ବିସ୍ଫୋରଣ) ଦେଖାଗଲା |b LLPS (ବାମ ପ୍ୟାନେଲ୍) ରୁ ପ୍ରାପ୍ତ ପୃଥକ αS / Tau441 ଏଗ୍ରିଗେଟର ଏକ ନମୁନାର FCS / FCCS ବିଶ୍ଳେଷଣ |AF488 ଏବଂ Atto647N ପାଇଁ ଅଟୋକୋରେଲେସନ୍ (AC) ବକ୍ରଗୁଡିକ ଯଥାକ୍ରମେ ନୀଳ ଏବଂ ନାଲି ରଙ୍ଗରେ ଦେଖାଯାଏ ଏବଂ ଉଭୟ ରଙ୍ଗ ଧାରଣ କରିଥିବା ଏଗ୍ରିଗେଟ୍ ସହିତ ଜଡିତ କ୍ରସ୍-କୋରିଆଲେସନ୍ (CC) ବକ୍ରଗୁଡିକ ବାଇଗଣୀ ରଙ୍ଗରେ ଦେଖାଯାଏ |ଏସି ବକ୍ରଗୁଡିକ ଲେବଲ୍ ହୋଇଥିବା ମୋନୋମେରିକ୍ ଏବଂ ଏକତ୍ରିତ ପ୍ରୋଟିନ୍ ପ୍ରଜାତିର ଉପସ୍ଥିତି ପ୍ରତିଫଳିତ କରୁଥିବାବେଳେ ସିସି ବକ୍ରଗୁଡ଼ିକ କେବଳ ଡବଲ୍-ଲେବଲ୍ ଏଗ୍ରିଗେଟଗୁଡିକର ବିସ୍ତାର ଦେଖାଏ |ସମାନ ବିଶ୍ଳେଷଣ, କିନ୍ତୁ ପୃଥକ ସମାଧାନ ପରି ସମାନ ସମାଧାନ ଅବସ୍ଥାରେ, କେବଳ ମୋନୋମେରିକ୍ αS ଏବଂ Tau441 ଧାରଣ କରିଥିବା ନମୁନାଗୁଡିକ ଡାହାଣ ପ୍ୟାନେଲରେ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ ଭାବରେ ଦେଖାଯାଏ |c αS / Tau441 ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋଷ୍ଟାଟିକ୍ କୋକ୍ରେଭେଟ୍ସରେ ଗଠିତ ବିଚ୍ଛିନ୍ନ ଏଗ୍ରିଗେଟଗୁଡିକର ଏକକ ଅଣୁଗୁଡ଼ିକର ଫ୍ଲୋରୋସେନ୍ସ ଫ୍ଲାସ୍ ବିଶ୍ଳେଷଣ |ଚାରୋଟି ଭିନ୍ନ ପୁନରାବୃତ୍ତି (N = 152) ରେ ମିଳୁଥିବା ପ୍ରତ୍ୟେକ ଏଗ୍ରିଗେଟ୍ ପାଇଁ ସୂଚନା ସେମାନଙ୍କ ଷ୍ଟୋଇଚିଓମିଟ୍ରି, S ମୂଲ୍ୟ, ଏବଂ FRET ଦକ୍ଷତା ବିରୁଦ୍ଧରେ ଷଡଯନ୍ତ୍ର କରାଯାଇଛି (ଉପର ପ୍ୟାନେଲ୍, ରଙ୍ଗ ଦଣ୍ଡ ଘଟଣା ପ୍ରତିଫଳିତ କରେ) |ତିନି ପ୍ରକାରର ଏଗ୍ରିଗେଟକୁ ପୃଥକ କରାଯାଇପାରିବ: -αS- କେବଳ S ~ 1 ଏବଂ FRET ~ 0 ସହିତ, କେବଳ S ~ 0 ଏବଂ FRET ~ 1 ସହିତ ଟାଉ-ଏଗ୍ରିଗେଟ୍ସ, ଏବଂ ମଧ୍ୟବର୍ତ୍ତୀ S ଏବଂ FRET ପରିମାଣର ହେଟେରୋଜିନସ୍ ଟାଉ / αS ଏଗ୍ରିଗେଟ୍ | ପ୍ରତ୍ୟେକ ହେଟେରୋଜିନ ଏଗ୍ରିଗେଟ୍ (N = 100) ରେ ଚିହ୍ନଟ ହୋଇଥିବା ଉଭୟ ମାର୍କର ପ୍ରୋଟିନ୍ ନିମ୍ନ ପ୍ୟାନେଲରେ ପ୍ରଦର୍ଶିତ ହୋଇଛି (ରଙ୍ଗ ସ୍କେଲ୍ ଘଟଣାକୁ ପ୍ରତିଫଳିତ କରିଥାଏ) |କଞ୍ଚା ତଥ୍ୟ ଫାଇଲ ଆକାରରେ କଞ୍ଚା ତଥ୍ୟ ପ୍ରଦାନ କରାଯାଇଛି |
ତରଳ ପ୍ରୋଟିନ କଣ୍ଡେନ୍ସେଟର ପରିପକ୍ୱତା କିମ୍ବା ବାର୍ଦ୍ଧକ୍ୟ ସମୟ ସହିତ ଜେଲ ପରି କିମ୍ବା କଠିନ ସଂରଚନାରେ କଣ୍ଡେନ୍ସେଟର ଅନେକ ଶାରୀରିକ କାର୍ଯ୍ୟରେ ତଥା ରୋଗରେ ମଧ୍ୟ ଜଡିତ ଥିବା ଜଣାଯାଇଛି, ଆମିଲଏଡ ଏଗ୍ରିଗେସନ୍ 7, 48, 49 ପୂର୍ବରୁ ଏକ ଅସ୍ୱାଭାବିକ ପ୍ରକ୍ରିୟା | ଆମେ ପର୍ଯ୍ୟାୟ ପୃଥକତା ଏବଂ ଆଚରଣକୁ ବିସ୍ତୃତ ଭାବରେ ଅଧ୍ୟୟନ କରୁ |କମ୍ ମାଇକ୍ରୋମୋଲାର୍ ଏକାଗ୍ରତା ଏବଂ ଶାରୀରିକ ସମ୍ବନ୍ଧୀୟ ସ୍ଥିତିରେ ନିୟନ୍ତ୍ରିତ ପରିବେଶରେ ଅନିୟମିତ ପଲିକେସନ୍ ର ଉପସ୍ଥିତିରେ LSPT αS (ଧ୍ୟାନ ଦିଅନ୍ତୁ ଯେ αS ର ଗଣିତ ଶାରୀରିକ ଏକାଗ୍ରତା> 1 µM50), LPS ର ସାଧାରଣ ଥର୍ମୋଡାଇନାମିକ୍ ଚାଳିତ ଆଚରଣ ଅନୁସରଣ କରି |ଆମେ ଜାଣିଲୁ ଯେ αS, ଯାହା ଶାରୀରିକ pH ରେ ଅତ୍ୟଧିକ ନକାରାତ୍ମକ ଚାର୍ଜ ହୋଇଥିବା ସି-ଟର୍ମିନାଲ୍ ଅଞ୍ଚଳ ଧାରଣ କରିଥାଏ, ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋଷ୍ଟାଟିକ୍ ପ୍ରକ୍ରିୟା ମାଧ୍ୟମରେ pLK କିମ୍ବା Tau ପରି ଉଚ୍ଚ କ୍ୟାଟେନିକ୍ ବିକୃତ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ଉପସ୍ଥିତିରେ LLPS ମାଧ୍ୟମରେ ଜଳୀୟ ଦ୍ରବଣରେ ପ୍ରୋଟିନ୍ ସମୃଦ୍ଧ ବୁନ୍ଦା ସୃଷ୍ଟି କରିବାରେ ସକ୍ଷମ | ଏକୀକରଣ ମାକ୍ରୋମୋଲ୍ୟୁକୁଲ୍ସର ଉପସ୍ଥିତିରେ ଜଟିଳ ଘନତ୍ୱ |ଏହି ପ୍ରକ୍ରିୟାର ସେଲ୍ୟୁଲାର୍ ପରିବେଶରେ ପ୍ରାସଙ୍ଗିକ ପ୍ରଭାବ ରହିପାରେ ଯେଉଁଠାରେ αS ଭିଟ୍ରୋ ଏବଂ ଭିଭୋ 51,5,5,5,5,54 ରେ ଏହାର ରୋଗ ସହ ଜଡିତ ଏକୀକରଣ ସହିତ ଜଡିତ ବିଭିନ୍ନ ପଲିକେସନ୍ ଅଣୁଗୁଡ଼ିକର ସାମ୍ନା କରିଥାଏ |
ଅନେକ ଅଧ୍ୟୟନରେ, ବୁନ୍ଦା ମଧ୍ୟରେ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଗତିଶୀଳତା ପରିପକ୍ୱତା ପ୍ରକ୍ରିୟା ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରୁଥିବା ଏକ ପ୍ରମୁଖ କାରଣ ଭାବରେ ବିବେଚନା କରାଯାଇଛି |ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋଷ୍ଟାଟିକ୍ αS ପଲିକେସନ୍ ସହିତ କୋଏକର୍ଭେଟରେ, ପରିପକ୍ୱତା ପ୍ରକ୍ରିୟା ବୋଧହୁଏ ପଲିକେସନ୍, ଭାଲେନ୍ସ ଏବଂ ଏହି ପାରସ୍ପରିକ କାର୍ଯ୍ୟର ବହୁଗୁଣ ସହିତ ପାରସ୍ପରିକ ଶକ୍ତି ଉପରେ ନିର୍ଭର କରେ |ସନ୍ତୁଳନ ତତ୍ତ୍ suggest ସୂଚିତ କରେ ଯେ ଦୁଇଟି ତରଳ ସ୍ଥିତିର ଏକ ସନ୍ତୁଳନ ଦୃଶ୍ୟ ବାୟୋପଲିମରରେ ଭରପୂର ଏକ ବଡ଼ ବୁନ୍ଦାଙ୍କ ଉପସ୍ଥିତି ହେବ ଯାହା LLPS57,58 ଚଳାଇଥାଏ |ଡ୍ରପଲେଟ୍ ଅଭିବୃଦ୍ଧି Ostwald ପରିପକ୍ୱତା 59, coalescence60 କିମ୍ବା ବିସ୍ତୃତ ପର୍ଯ୍ୟାୟରେ ମାଗଣା ମୋନୋମର ବ୍ୟବହାର ଦ୍ୱାରା ହାସଲ ହୋଇପାରିବ |SS ଏବଂ Tau441, tNt-Tau କିମ୍ବା pLK ପାଇଁ, ଅଧିକାଂଶ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଏହି ଅଧ୍ୟୟନରେ ବ୍ୟବହୃତ ଅବସ୍ଥାରେ କଣ୍ଡେନ୍ସେଟରେ ଏକାଗ୍ର ହୋଇଥିଲା |ଅବଶ୍ୟ, ଯେତେବେଳେ ଫୁଲ୍ ସାଇଜ୍ ଟାଉ ଡ୍ରପଲେଟ୍ ଗୁଡିକ ଭୂପୃଷ୍ଠ ଓଦା ଉପରେ ଦ୍ରୁତ ଗତିରେ ଏକତ୍ରିତ ହୋଇଥିଲେ, ଡ୍ରପଲେଟ୍ କୋଏଲେସେନ୍ସ ଏବଂ ୱେଟିଂ tNt-Tau ଏବଂ pLK ପାଇଁ କଷ୍ଟସାଧ୍ୟ ଥିଲା, ଏହି ଦୁଇଟି ସିଷ୍ଟମରେ ତରଳ ଗୁଣର ଶୀଘ୍ର ନଷ୍ଟ ହେବାର ପରାମର୍ଶ ଦେଇଥାଏ |ଆମର FLIM-FRET ବିଶ୍ଳେଷଣ ଅନୁଯାୟୀ, ବୃଦ୍ଧ pLK ଏବଂ tNt-Tau ବୁନ୍ଦା ମୂଳ ଡ୍ରପଲେଟ୍ ପରି ସମାନ ଡିଗ୍ରୀ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଏଗ୍ରିଗେସନ୍ (ସମାନ ଫ୍ଲୋରୋସେନ୍ସ ଆଜୀବନ) ଦେଖାଇଲା, ମୂଳ ପ୍ରୋଟିନ୍ ନେଟୱାର୍କ ଅଧିକ କଠିନ ହୋଇଥିଲେ ମଧ୍ୟ ଏହା ସୂଚିତ କରେ |
ଆମେ ଆମର ପରୀକ୍ଷାମୂଳକ ଫଳାଫଳକୁ ନିମ୍ନ ମଡେଲରେ ଯୁକ୍ତିଯୁକ୍ତ (ଚିତ୍ର 8) |ପ୍ରାରମ୍ଭରେ ଅସ୍ଥାୟୀ ଭାବରେ ଗଠିତ ବୁନ୍ଦା ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋଷ୍ଟାଟିକ୍ କ୍ଷତିପୂରଣ ବିନା ପ୍ରାୟତ protein ପ୍ରୋଟିନ୍ ନେଟୱାର୍କ ଅଟେ, ଏବଂ ଏହିପରି ଚାର୍ଜ ଅସନ୍ତୁଳନର କ୍ଷେତ୍ର ଅଛି, ବିଶେଷତ the ଡ୍ରପଲେଟ୍ ଇଣ୍ଟରଫେସରେ, ଯାହାଫଳରେ ଏକ ଉଚ୍ଚ ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋଷ୍ଟାଟିକ୍ ଭୂପୃଷ୍ଠର ସମ୍ଭାବନା ଥାଏ |ଚାର୍ଜର କ୍ଷତିପୂରଣ ଦେବା ପାଇଁ (ଏକ ଘଟଣା ସାଧାରଣତ va ଭାଲେନ୍ସ ହ୍ରାସ ବୋଲି କୁହାଯାଏ) ଏବଂ ବୁନ୍ଦା ର ଭୂପୃଷ୍ଠ ସମ୍ଭାବନାକୁ କମ୍ କରିବାକୁ, ଡ୍ରପଲେଟ୍ ଗୁଡିକ ମିଶ୍ରିତ ପର୍ଯ୍ୟାୟରୁ ନୂତନ ପଲିପେପ୍ଟାଇଡ୍ ଅନ୍ତର୍ଭୂକ୍ତ କରିପାରନ୍ତି, ଚାର୍ଜ-ଚାର୍ଜ ପାରସ୍ପରିକ କାର୍ଯ୍ୟକୁ ଅପ୍ଟିମାଇଜ୍ କରିବା ପାଇଁ ପ୍ରୋଟିନ୍ ନେଟୱାର୍କକୁ ପୁନ organ ସଂଗଠିତ କରିପାରନ୍ତି ଏବଂ ଅନ୍ୟ ବୁନ୍ଦା ସହିତ ଯୋଗାଯୋଗ କରିପାରନ୍ତି |ପୃଷ୍ଠଗୁଡ଼ିକ ସହିତ (ଓଦା) |SimpleS / pLK ବୁନ୍ଦା, ସେମାନଙ୍କର ସରଳ ପ୍ରୋଟିନ୍ ନେଟୱାର୍କ (କେବଳ αS ଏବଂ pLK ମଧ୍ୟରେ ହେଟେରୋଟାଇପ୍ ପାରସ୍ପରିକ କ୍ରିୟା) ଏବଂ ପ୍ରୋଟିନ୍-ପ୍ରୋଟିନ୍ ପାରସ୍ପରିକ ପାରସ୍ପରିକ ସମ୍ପର୍କ ପାଇଁ ଅଧିକ ଘନିଷ୍ଠତା ହେତୁ, କଣ୍ଡେନ୍ସେଟର ଚାର୍ଜକୁ ଶୀଘ୍ର ସନ୍ତୁଳିତ କରିବାରେ ସକ୍ଷମ ମନେହୁଏ;ବାସ୍ତବରେ, αS / Tau ଅପେକ୍ଷା ପ୍ରାରମ୍ଭରେ ଗଠିତ αS / pLK କୋଏକର୍ଭେଟରେ ଆମେ ଶୀଘ୍ର ପ୍ରୋଟିନ୍ ଗତିଜତା ଦେଖିଲୁ |ଭାଲେନ୍ସ ହ୍ରାସ ପରେ, ପାରସ୍ପରିକ କ୍ରିୟା କମ୍ ଏଫେମେରାଲ୍ ହୋଇଯାଏ ଏବଂ ବୁନ୍ଦାମାନେ ସେମାନଙ୍କର ତରଳ ଗୁଣ ହରାନ୍ତି ଏବଂ କମ୍ ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋଷ୍ଟାଟିକ୍ ଭୂପୃଷ୍ଠ ସମ୍ଭାବନା ସହିତ ଜେଲ୍ ପରି, ଜ୍ୱଳନ୍ତ ନଥିବା ବୁନ୍ଦା ରେ ପରିଣତ ହୁଅନ୍ତି (ଏବଂ ସେଥିପାଇଁ ଭୂପୃଷ୍ଠକୁ ଓଦା କରିବାରେ ଅସମର୍ଥ) |ଏହାର ବିପରୀତରେ, ଅଧିକ ଜଟିଳ ପ୍ରୋଟିନ୍ ନେଟୱାର୍କ (ଉଭୟ ହୋମୋଟାଇପିକ୍ ଏବଂ ହେଟେରୋଟାଇପିକ୍ ପାରସ୍ପରିକ କ୍ରିୟା ସହିତ) ଏବଂ ପ୍ରୋଟିନ୍ ପାରସ୍ପରିକ ଦୁର୍ବଳତା ହେତୁ ଡ୍ରପଲେଟ୍ ଚାର୍ଜ ସନ୍ତୁଳନକୁ ଅପ୍ଟିମାଇଜ୍ କରିବାରେ αS / Tau ବୁନ୍ଦା କମ୍ ଦକ୍ଷ |ଏହା ଫଳସ୍ୱରୂପ ଡ୍ରପଲେଟଗୁଡିକ ଯାହାକି ବର୍ଦ୍ଧିତ ସମୟ ପାଇଁ ତରଳ ଆଚରଣକୁ ବଜାୟ ରଖେ ଏବଂ ଏକ ଉଚ୍ଚ ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋଷ୍ଟାଟିକ୍ ଭୂପୃଷ୍ଠ ସମ୍ଭାବନା ପ୍ରଦର୍ଶନ କରେ ଯାହା ଏକତ୍ରିତ ହେବା ଏବଂ ବ growing ିବା ଦ୍ୱାରା କମ୍ ହୋଇଯାଏ (ଏହିପରି ଡ୍ରପଲେଟ୍ସର ଭୂପୃଷ୍ଠ / ପରିମାଣ ଅନୁପାତକୁ କମ୍ କରି) ଏବଂ ହାଇଡ୍ରୋଫିଲିକ୍ ଭୂପୃଷ୍ଠ କେମକୁ ଓଦା କରି |ଏହା ବୃହତ ଏକାଗ୍ର ପ୍ରୋଟିନ୍ ଲାଇବ୍ରେରୀ ସୃଷ୍ଟି କରେ ଯାହା ପ୍ରୋଟିନ୍ ନେଟୱାର୍କରେ ଚାର୍ଜ ଅପ୍ଟିମାଇଜେସନ୍ ପାଇଁ କ୍ରମାଗତ ସନ୍ଧାନ ହେତୁ ପାରସ୍ପରିକ ଗୁଣ ଅତ୍ୟନ୍ତ କ୍ଷଣସ୍ଥାୟୀ ରହିଥାଏ |କ Interest ତୁହଳର ବିଷୟ, ଟାଉର N- ଟର୍ମିନାଲ୍ କଟିଯାଇଥିବା ଫର୍ମଗୁଡିକ, କିଛି ପ୍ରାକୃତିକ ଭାବରେ ଘଟୁଥିବା ଆଇସୋଫର୍ମସ୍ 62 ସହିତ ମଧ୍ୟବର୍ତ୍ତୀ ଆଚରଣ ପ୍ରଦର୍ଶନ କରେ, କେତେକ କୋସର୍ଭେଟ୍ αS ସହିତ ଦୀର୍ଘଜୀବୀ ଜେଲ୍ ପରି ବୁନ୍ଦା ସହିତ ବୃଦ୍ଧାବସ୍ଥା ସହିତ ଅନ୍ୟମାନେ ବଡ଼ ତରଳ କଣ୍ଡେନ୍ସେଟରେ ପରିଣତ ହେଲେ |SS ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋଷ୍ଟାଟିକ୍ କୋକ୍ରେଭେଟ୍ସର ପରିପକ୍ .ତା ମଧ୍ୟରେ ଏହି ଦ୍ୱ ual ତ୍ୟ ସାମ୍ପ୍ରତିକ LLPS ତତ୍ତ୍ୱଗତ ଏବଂ ପରୀକ୍ଷାମୂଳକ ଅଧ୍ୟୟନ ସହିତ ସମାନ ଅଟେ ଯାହା କଣ୍ଡେନ୍ସେଟ୍ ଆକାର ଏବଂ ତରଳ ଗୁଣକୁ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ କରିବାର ଏକ ଚାବି ଭାବରେ ଭାଲେନ୍ସ ହ୍ରାସ ଏବଂ କଣ୍ଡେନ୍ସେଟରେ ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋଷ୍ଟାଟିକ୍ ସାଇଭିଂ ମଧ୍ୟରେ ସମ୍ପର୍କକୁ ଚିହ୍ନଟ କରିଛି |ଯାନ୍ତ୍ରିକତା 58.61
ଏହି ସ୍କିମ୍ LLPS ଏବଂ LSPT ମାଧ୍ୟମରେ αS ଏବଂ Tau441 ପାଇଁ ପୁଟିଭ୍ ଆମିଲଏଡ୍ ଏଗ୍ରିଗେସନ୍ ପଥ ଦେଖାଏ |ଅତିରିକ୍ତ ଆୟନ-ସମୃଦ୍ଧ (ନାଲି) ଏବଂ କାଟେସନ୍-ସମୃଦ୍ଧ (ନୀଳ) ଅଞ୍ଚଳ ସହିତ, αS ଏବଂ ଟାଉ ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋଷ୍ଟାଟିକ୍ କୋଏକର୍ଭେଟ୍ ସନ୍ତୋଷଜନକ ଭାଲେନ୍ସ ସହିତ ଭୂପୃଷ୍ଠର ଶକ୍ତି କମ୍ ଥାଏ ଏବଂ ସେଥିପାଇଁ କମ୍ ସମନ୍ୱୟ ରହିଥାଏ, ଫଳସ୍ୱରୂପ ଦ୍ରୁତ ଡ୍ରପଲେଟ୍ ବାର୍ଦ୍ଧକ୍ୟ |ଏକ ସ୍ଥିର ଅଣ-ଏକତ୍ରିକୃତ ଜେଲ୍ ସ୍ଥିତି ହାସଲ ହୁଏ |।ଏହି ପରିସ୍ଥିତି αS / pLK ସିଷ୍ଟମ୍ କ୍ଷେତ୍ରରେ ଅଧିକ ଅନୁକୂଳ ଏବଂ ସରଳ ପ୍ରୋଟିନ୍-ଯୁଗଳ ପାରସ୍ପରିକ ନେଟୱାର୍କ ହେତୁ ଅତ୍ୟନ୍ତ ଅନୁକୂଳ ଅଟେ, ଯାହା ଏକ ଦ୍ରୁତ ଜେଲ୍ ପରି ପରିବର୍ତ୍ତନ ପାଇଁ ଅନୁମତି ଦେଇଥାଏ |ଅପରପକ୍ଷେ, ଅସନ୍ତୁଷ୍ଟ ଭାଲେନ୍ସ ସହିତ ବୁନ୍ଦା ଏବଂ ତେଣୁ, ପାରସ୍ପରିକ ଚାର୍ଜ ପାଇଁ ଉପଲବ୍ଧ ପ୍ରୋଟିନ୍-ଚାର୍ଜଯୁକ୍ତ ଅଞ୍ଚଳ, ଏହାର ଉଚ୍ଚ ପୃଷ୍ଠ ଶକ୍ତି ହ୍ରାସ କରିବା ପାଇଁ ହାଇଡ୍ରୋଫିଲିକ୍ ପୃଷ୍ଠକୁ ଫ୍ୟୁଜ୍ ଏବଂ ଓଦା କରିବା କୋଏକର୍ଭେଟ୍ ପାଇଁ ସହଜ କରିଥାଏ |ଏହି ପରିସ୍ଥିତି αS / Tau441 coacervates ପାଇଁ ଅଧିକ ପସନ୍ଦ, ଯାହାର ଦୁର୍ବଳ Tau-Tau ଏବଂ αS-Tau ପାରସ୍ପରିକ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପକୁ ନେଇ ଏକ ବହୁମୁଖୀ ଜଟିଳ ନେଟୱାର୍କ ଅଛି |ପ୍ରତିବଦଳରେ, ବୃହତ କୋଏକର୍ଭେଟଗୁଡିକ ସେମାନଙ୍କର ତରଳ ପରି ଗୁଣକୁ ଅତି ସହଜରେ ବଜାୟ ରଖିବେ, ଯାହାକି ଅନ୍ୟ ପ୍ରୋଟିନ୍-ରୁ-ପ୍ରୋଟିନ୍ ପାରସ୍ପରିକ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପକୁ ଅନୁମତି ଦେବ |ପରିଶେଷରେ, କୋଏକର୍ଭେଟ୍ ଫ୍ଲୁଇଡ୍ ମଧ୍ୟରେ ଉଭୟ αS ଏବଂ ଟାଉ ଫର୍ମ ଧାରଣ କରିଥିବା ଆମିଲଏଡ୍ ହେଟେରୋଜିନସ୍ ଏଗ୍ରିଗେଟ୍ସ, ଯାହା ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତ ଶରୀରରେ ମିଳୁଥିବା ଲୋକଙ୍କ ସହିତ ଜଡିତ ହୋଇପାରେ, ଯାହା ନ୍ୟୁରୋଡେଜେନେରେଟିଭ୍ ରୋଗର ଚିହ୍ନ ଅଟେ |
ଏକ ବୃହତ ସଂଲଗ୍ନ କିନ୍ତୁ ଗତିଶୀଳ ପ୍ରୋଟିନ୍ ପରିବେଶ ସହିତ αS / Tau441 ର ପରିପକ୍ .ତା ସମୟରେ ଗଠିତ ବୃହତ ତରଳ ପରି ଗଠନ ଏବଂ, କମ୍ ପରିମାଣରେ, αS / ΔNt-Tau coacervates ପ୍ରୋଟିନ୍ ଏକୀକରଣର ନ୍ୟୁକ୍ଲିୟେସନ୍ ପାଇଁ ଆଦର୍ଶ ଜଳଭଣ୍ଡାର |ଆମେ ପ୍ରକୃତରେ ଏହି ପ୍ରକାରର ପ୍ରୋଟିନ୍ କୋଏକର୍ଭେଟରେ କଠିନ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଏଗ୍ରିଗେଟ୍ ଗଠନ ଉପରେ ନଜର ରଖିଛୁ, ପ୍ରାୟତ both ଉଭୟ αS ଏବଂ ଟାଉ ଧାରଣ କରିଥାଏ |ଆମେ ଦେଖାଇଛୁ ଯେ ଏହି ହେଟେରୋଗ୍ରେଗେଟ୍ ଗୁଡିକ ଅଣ-ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋଷ୍ଟାଟିକ୍ ପାରସ୍ପରିକ କ୍ରିୟା ଦ୍ୱାରା ସ୍ଥିର ହୋଇଥାନ୍ତି, ଆମିଲଏଡ୍-ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ThT ରଙ୍ଗକୁ ସାଧାରଣ ଆମିଲଏଡ୍ ଫାଇବ୍ରିଲ୍ ସହିତ ସମାନ ଭାବରେ ବାନ୍ଧିବାରେ ସକ୍ଷମ ଅଟନ୍ତି ଏବଂ ପ୍ରକୃତରେ ବିଭିନ୍ନ ପ୍ରଭାବ ଉପରେ ସମାନ ପ୍ରତିରୋଧ କରନ୍ତି |LLPS ଦ୍ formed ାରା ଗଠିତ αS / tau ଏଗ୍ରିଗେଟ୍ ଗୁଡିକରେ ଆମିଲଏଡ୍ ପରି ଗୁଣ ଥିବା ଦେଖାଯାଇଥିଲା |ବାସ୍ତବରେ, ଆମ୍ଲୋଏଡ୍ ଏଗ୍ରିଗେସନ୍ରେ ଟାଉ ଅଭାବର ପରିପକ୍ୱ ପ୍ରକାର, ତରଳ ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋଷ୍ଟାଟିକ୍ କୋକ୍ରେଭେଟ୍ ମଧ୍ୟରେ ଏହି ହେଟେରୋଜିନସ୍ αS ଏଗ୍ରିଗେଟ୍ ଗଠନରେ ଯଥେଷ୍ଟ ବାଧାପ୍ରାପ୍ତ |CoS / Tau441 ଏଗ୍ରିଗେଟ୍ ଗଠନ କେବଳ କୋକ୍ରେଭେଟ୍ ଭିତରେ ଦେଖାଗଲା, ଯାହା ତରଳ ପରି ଗୁଣଗୁଡିକ ବଜାୟ ରଖିଥାଏ, ଏବଂ ଯଦି କ co ଣସି କଭର୍ଭେଟ୍ / ବୁନ୍ଦା ଜେଲ୍ ସ୍ଥିତିରେ ପହଞ୍ଚିନଥାଏ |ପରବର୍ତ୍ତୀ କ୍ଷେତ୍ରରେ, ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋଷ୍ଟାଟିକ୍ ପାରସ୍ପରିକ କ୍ରିୟାଗୁଡ଼ିକର ବର୍ଦ୍ଧିତ ଶକ୍ତି ଏବଂ ଫଳସ୍ୱରୂପ, ପ୍ରୋଟିନ୍ ନେଟୱାର୍କର ଦୃ id ତା ଆମିଲଏଡ୍ ନ୍ୟୁକ୍ଲିୟେସନ୍ ପାଇଁ ଆବଶ୍ୟକ ନୂତନ ପ୍ରୋଟିନ୍ ପାରସ୍ପରିକ ସମ୍ପର୍କ ସ୍ଥାପନ ପାଇଁ ପ୍ରୋଟିନର ଆବଶ୍ୟକୀୟ ଗଠନମୂଳକ ପୁନ ang ସଜ୍ଜନକୁ ରୋକିଥାଏ |ଅବଶ୍ୟ, ଏହା ଅଧିକ ନମନୀୟ, ତରଳ ପରି କୋଏକର୍ଭେଟରେ ହାସଲ ହୋଇପାରିବ, ଯାହା ଆକାରରେ ବୃଦ୍ଧି ହେତୁ ତରଳ ରହିବାର ସମ୍ଭାବନା ଅଧିକ |
ଘନ ଘନ ଘନ ଘନ ଘନ ଘନ ଘନ ଘନ ଘନ ଘନ ଘନ ଘନ ଘନ ଘନ ଘନ ଘନ ଘନ ଘନ ଘନ ଘନ ଘନ ଘନ ଘନ ଘନ ଘନ ଘନ ଘନ ଘନ ଘନ ଘନ ଘନ ଘନ ଘନ ଘନ ଘନ ଘନ ଘନ ଘନ ଘନ ଘନ ଘନ ଘନ ଘନ,ଏହିପରି, କେବଳ ପର୍ଯ୍ୟାୟ ପୃଥକତା ପାଇଁ ଏକ ପ୍ରବୃତ୍ତି ନୁହେଁ, ସଠିକ୍ କାର୍ଯ୍ୟ କରିବା ସହିତ ରୋଗ ନିରାକରଣ ପାଇଁ କଣ୍ଡେନ୍ସେଟର ଆକାରକୁ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ କରାଯିବା ଆବଶ୍ୟକ 58,61 |ଆମର ଫଳାଫଳଗୁଡିକ αS / Tau ସିଷ୍ଟମ୍ ପାଇଁ LLPS ଏବଂ LSPT ମଧ୍ୟରେ ସନ୍ତୁଳନର ଗୁରୁତ୍ୱକୁ ମଧ୍ୟ ଆଲୋକିତ କରେ |ଅନ୍ୟାନ୍ୟ ସିଷ୍ଟମରେ 63,64 ରେ ପ୍ରସ୍ତାବିତ ପରି ପରିପୃଷ୍ଟ ଅବସ୍ଥାରେ ଉପଲବ୍ଧ ପ୍ରୋଟିନ୍ ମନୋମର ପରିମାଣକୁ ହ୍ରାସ କରି ଡ୍ରପଲେଟ୍ ଗଠନ ଆମିଲଏଡ୍ ଏଗ୍ରିଗେସନ୍ ଠାରୁ ରକ୍ଷା କରିପାରିବ, ଉଚ୍ଚ ଡ୍ରପଲେଟ୍ ସ୍ତରରେ ଡ୍ରପଲେଟ୍ ଫ୍ୟୁଜନ୍ ଧୀର ଗଠନମୂଳକ ପୁନ arr ବ୍ୟବସ୍ଥା ମାଧ୍ୟମରେ ଆଭ୍ୟନ୍ତରୀଣ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଏକୀକରଣକୁ ନେଇପାରେ |ପ୍ରୋଟିନ୍ ନେଟୱାର୍କ |।
ସାମଗ୍ରିକ ଭାବରେ, ଆମର ତଥ୍ୟ LSPT ପରିପ୍ରେକ୍ଷୀରେ ଡ୍ରପ୍ ନେଟୱାର୍କରେ ମିଳିତ ଭାଲେନ୍ସ ଏବଂ ସନ୍ତୁଷ୍ଟ / ଅସନ୍ତୁଷ୍ଟ ପାରସ୍ପରିକ ସମ୍ପର୍କର ପ୍ରାସଙ୍ଗିକତାକୁ ଦୃ strongly ଭାବରେ ଗୁରୁତ୍ୱ ଦେଇଥାଏ |ବିଶେଷ ଭାବରେ, ଆମେ ଦେଖାଉଛୁ ଯେ ପୂର୍ଣ୍ଣ ଦ length ର୍ଘ୍ୟ αS / Tau441 କଣ୍ଡେନ୍ସେଟ୍ ଫଳପ୍ରଦ ଭାବରେ ଫ୍ୟୁଜ୍ ଏବଂ ନ୍ୟୁକ୍ଲିଏଟ୍ କରିବାକୁ ଆମିଲଏଡ୍ ପରି ହେଟେରୋଗ୍ରେଗେଟ୍ ଗଠନ କରିବାରେ ସକ୍ଷମ, ଯାହା ଉଭୟ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଅନ୍ତର୍ଭୂକ୍ତ କରେ ଏବଂ ଆମର ପରୀକ୍ଷାମୂଳକ ଫଳାଫଳ ଉପରେ ଆଧାର କରି ଏକ ମଲିକୁଲାର ପ୍ରଣାଳୀ ପ୍ରସ୍ତାବ ଦେଇଥାଏ |ଆମେ ଏଠାରେ ରିପୋର୍ଟ କରୁଥିବା αS / Tau ଫ୍ଲୁଇଡ୍ କୋଏକର୍ଭେଟରେ ଦୁଇଟି ପ୍ରୋଟିନର ସହ-ଏକତ୍ରିକରଣ ପ୍ରକୃତରେ ଦୁଇଟି ପ୍ରୋଟିନର ସହ-ଲୋକାଲାଇଜେସନ୍ ସହିତ ଜଡିତ ହୋଇପାରେ, ଯାହା ରୋଗର ଚିହ୍ନ ଅଟେ, ଏବଂ LLPS ଏବଂ ସମ୍ପର୍କ ବୁ understanding ିବାରେ ସହାୟକ ହୋଇପାରେ | ନ୍ୟୁରୋଡେଜେନେରେସନ୍ ରେ ଅତ୍ୟଧିକ ଚାର୍ଜ ହୋଇଥିବା IDP ପାଇଁ ବାଟ ଖୋଲିବା ପାଇଁ ଆମିଲଏଡ୍ ଏଗ୍ରିଗେସନ୍ |
ମୋନୋମେରିକ୍ WT-αS, ସିଷ୍ଟାଇନ୍ ମ୍ୟୁଟାଣ୍ଟସ୍ (Q24C-αS, N122C-αS) ଏବଂ ΔCt-αS ପ୍ରକାରଗୁଡିକ (Δ101-140) ଇ କୋଲିରେ ପ୍ରକାଶ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ପୂର୍ବରୁ ବର୍ଣ୍ଣନା କରାଯାଇଥିବା ପରି ଶୁଦ୍ଧ କରାଯାଇଥିଲା |ଡିସଲଫାଇଡ୍ ବଣ୍ଡ ଗଠନକୁ ରୋକିବା ପାଇଁ αS ସିଷ୍ଟାଇନ୍ ମ୍ୟୁଟାଣ୍ଟଗୁଡିକର ଶୁଦ୍ଧକରଣରେ 5 ମିମି DTT ସମସ୍ତ ପଦକ୍ଷେପରେ ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତ କରାଯାଇଥିଲା |Tau441 ଆଇସୋଫର୍ମ (ଆଡ୍ଗେନ # 16316 ରୁ ପ୍ରାପ୍ତ ପ୍ଲାସିମ), tNt-Tau ପ୍ରକାର (Δ1-150, ପ୍ରାଇମର୍ CTTTAAGAAGGAGATACATATGATCGCCACACCGCGG, CATATGTATATCCTCTCTTCTTAAAGTTAAAC2) ପ୍ରାଥମିକ) ଇ କୋଲି ସଂସ୍କୃତିଗୁଡ଼ିକ ଥିଲା | 37 ° C ଏବଂ 180 rpm ରେ OD600 = 0.6–0.7 କୁ ବୃଦ୍ଧି ପାଇଲା, ଏବଂ 37 ° C ରେ 3 ​​ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ ଅଭିବ୍ୟକ୍ତି IPTG ସହିତ ପ୍ରେରିତ ହେଲା |4 ° C ରେ 15 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ 11,500 xg ରେ କୋଷ ଅମଳ କରନ୍ତୁ ଏବଂ 150 ମିଟର NaCl ଧାରଣ କରିଥିବା ସାଲାଇନ୍ ବଫର୍ ସହିତ ଧୋଇ ଦିଅନ୍ତୁ |ଲାଇସିସ୍ ବଫରରେ ପେଲେଟକୁ ପୁନ us ପଠାନ୍ତୁ (1 L LB ପ୍ରତି 20 ମିଲି: MES 20 mM, pH 6.8, NaCl 500 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 0.2 mM, DTT 5 mM, PMSF 1 mM, benzamidine 50 μM, copeptin 100 μM) |ସୋନିକେସନ୍ ଷ୍ଟେପ୍ ବରଫ ଉପରେ 10 ଟି ଡାଲି ପାଇଁ 80% ବିସ୍ତାର ସହିତ କରାଯାଇଥିଲା (1 ମିନିଟ୍, 1 ମିନିଟ୍ ଅଫ୍) |ଗୋଟିଏ ଅଲଟ୍ରାସାଉଣ୍ଡରେ 60 ମିଲିରୁ ଅଧିକ ହୁଅନ୍ତୁ ନାହିଁ |ଇ କୋଲି ଲାଇସେଟ୍ ଗୁଡିକ 95 ° C ରେ 20 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ ଗରମ କରାଯାଇଥିଲା, ତା’ପରେ ବରଫରେ ଥଣ୍ଡା ହୋଇ 407 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ 127,000 × g ରେ ସେଣ୍ଟ୍ରିଫୁଗ୍ କରାଯାଇଥିଲା |ସ୍ପଷ୍ଟ ହୋଇଥିବା ଅଲ ern କିକ ତତ୍ତ୍ୱକୁ 3.5 kDa ମେମ୍ବ୍ରେନ୍ (ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରମ୍ ™ ଥର୍ମୋ ଫିସର ସାଇଣ୍ଟିଫିକ୍, ୟୁକେ) ରେ ପ୍ରୟୋଗ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ 4 L ଡାଏଲିସିସ୍ ବଫର୍ (20 mM MES, pH 6.8, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 2 mM, DTT 2 mM) ଉପରେ ଡାଏଲିଜ୍ କରାଯାଇଥିଲା | , PMSF 0.1 mM) 10 ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ |ଏକ 5 ମି.ଲି.ଟାଉ ଲାଇସେଟ୍ ଏକ 0.22 μm PVDF ଫିଲ୍ଟର୍ ମାଧ୍ୟମରେ ଫିଲ୍ଟର୍ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ 1 ମିଲି / ମିନିଟ୍ ପ୍ରବାହ ହାରରେ ସ୍ତମ୍ଭରେ ଇଞ୍ଜେକ୍ସନ ଦିଆଯାଇଥିଲା |ଧୀରେ ଧୀରେ ଏଲିଟେସନ୍ କରାଯାଇଥିଲା, ଟାଉକୁ 15-30% ଏଲିଟେସନ୍ ବଫର୍ (20 mM MES, pH 6.8, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0.1 mM PMSF) ସହିତ ବ uted ଼ାଯାଇଥିଲା |ଭଗ୍ନାଂଶଗୁଡିକ SDS-PAGE ଦ୍ analy ାରା ବିଶ୍ଳେଷଣ କରାଯାଇଥିଲା, ଏବଂ ଟାଉର ଆଶା କରାଯାଉଥିବା ମଲିକୁଲାର୍ ଓଜନ ସହିତ ଗୋଟିଏ ବ୍ୟାଣ୍ଡ ଧାରଣ କରିଥିବା ଯେକ any ଣସି ଭଗ୍ନାଂଶଗୁଡିକ 10 kDa ସେଣ୍ଟ୍ରିଫୁଗ୍ ଫିଲ୍ଟର୍ ବ୍ୟବହାର କରି ଏକାଗ୍ର ହୋଇ 10 ମିଟର HEPES, pH 7.4, NaCl 500 mM ଏବଂ DTT 2 mM ପାଇଁ ଏକ ବଫର୍ ସହିତ ସ୍ଥାନିତ ହୋଇଥିଲା | ଅନ୍ତିମ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଏକାଗ୍ରତା 100 μM ଥିଲା |ତାପରେ ପ୍ରୋଟିନ୍ ସଲ୍ୟୁସନ୍ ଏକ 0.22 μm PVDF ଫିଲ୍ଟର୍ ଦେଇ ପାସ୍ ହୋଇଗଲା, ଶୀଘ୍ର ଫ୍ରିଜ୍ ହୋଇ -80 ° C ରେ ଗଚ୍ଛିତ ହେଲା |ପ୍ରୋଟିନ୍ K18 ଦୟାକରି ପ୍ରଫେସର ଆଲବର୍ଟୋ ବଫିଙ୍କ ଦ୍ provided ାରା ପ୍ରଦାନ କରାଯାଇଥିଲା।SDS-PAGE ଏବଂ MALDI-TOF / TOF ଦ୍ୱାରା ନିଶ୍ଚିତ ହୋଇଥିବା ପ୍ରସ୍ତୁତିର ଶୁଦ୍ଧତା 95% ଥିଲା |ବିଭିନ୍ନ ସିଷ୍ଟାଇନ୍ ଗୁଡିକ ରାସାୟନିକ ଭାବରେ ଆଲେକ୍ସା ଫ୍ଲୋର 488-ମେନିମାଇଡ୍ (AF488, ଥର୍ମୋ ଫିସର ସାଇଣ୍ଟିଫିକ୍, ୱାଲ୍ଟାମ, MA, ଯୁକ୍ତରାଷ୍ଟ୍ର) କିମ୍ବା TEMPOL-maleimide (ଟରୋଣ୍ଟୋ ରିସର୍ଚ୍ଚ କେମିକାଲ୍ସ, ଟରୋଣ୍ଟୋ, କାନାଡା) ସହିତ ଲେବଲ୍ କରାଯାଇଥିଲା |ଅବଶୋଷଣ ଏବଂ MALDI-TOF / TOF ଦ୍ୱାରା ନିଶ୍ଚିତ କରାଯାଇଥିଲା |ସମାନ ପ୍ରଣାଳୀ ଅନୁସରଣ କରି Tau441, tNt-Tau, AggDef-Tau ଏବଂ K18 କୁ 191 ଏବଂ 322 ସ୍ଥିତିରେ ଦେଶୀ ସିଷ୍ଟାଇନ୍ ଅବଶିଷ୍ଟାଂଶ ସହିତ ଲେବଲ୍ କରାଯାଇଥିଲା |IdS ଏବଂ Tau441 ପାଇଁ ଅବଶିଷ୍ଟ ମାନଚିତ୍ରଗୁଡିକ ପାଇଁ ନିଟ୍ ଚାର୍ଜ CIDER66 ବ୍ୟବହାର କରି ସୃଷ୍ଟି କରାଯାଇଥିଲା |
ସଲିଡ୍ ପଲି-ଏଲ୍-ଲାଇସେନ୍ (ଯୋଗାଣକାରୀଙ୍କ ଠାରୁ NMR ଅନୁଯାୟୀ pLK DP 90-110, ଆଲାମାଣ୍ଡା ପଲିମରସ୍ ଇନ୍, ହଣ୍ଟସଭିଲ୍, ଆଲାବାମା, ଯୁକ୍ତରାଷ୍ଟ୍ର) 10 ମିଟର HEPES, 100 mM NaCl, pH 7.4 ରୁ 10 ମିଟର ଏକାଗ୍ରତାରେ ଦ୍ରବଣ କରାଯାଇଥିଲା, ପ୍ରକ୍ରିୟା 5 ପାଇଁ ସୋନିକେଟ୍ ହୋଇଥିଲା | ଅଲଟ୍ରାସୋନିକ୍ ପାଣି ସ୍ନାନରେ ମିନିଟ୍ ଏବଂ -20 ° C ରେ ଗଚ୍ଛିତ କରନ୍ତୁ |PEG-8, dextran-70, FITC-PEG-10 (ବାୟୋକେମ୍ପେଗ୍, ୱାଟର୍ଟାଉନ୍, MA, ଯୁକ୍ତରାଷ୍ଟ୍ର) ଏବଂ FITC-dextran-500 (ସିଗମା-ଆଲଡ୍ରିଚ୍, ସାଣ୍ଟ ଲୁଇସ୍, MI, ଯୁକ୍ତରାଷ୍ଟ୍ର) ଜଳ ଦ୍ରବଣୀୟ ଏବଂ LLPS ବଫରରେ ବହୁଳ ଭାବରେ ବିତରଣ |ଡାୟଲିସିସ୍ ଦୂଷିତ ଲୁଣକୁ ବାହାର କରିଥାଏ |ଏହା ପରେ ସେଗୁଡିକ ଏକ ସିରିଞ୍ଜ ଫିଲ୍ଟର ମାଧ୍ୟମରେ 0.22 μm ଆକାର ବିଶିଷ୍ଟ ଫିଲ୍ଟର୍ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ଏକ ରେଫ୍ରାକ୍ଟୋମିଟର (ମେଟଲର୍ ଟୋଲେଡୋ, କଲମ୍ବସ୍, ଓହିଓ, ଯୁକ୍ତରାଷ୍ଟ୍ର) ବ୍ୟବହାର କରି ସେମାନଙ୍କର ଏକାଗ୍ରତା ଗଣନା କରାଯାଇଥିଲା |ନିମ୍ନ କ୍ରମରେ କୋଠରୀ ତାପମାତ୍ରାରେ LLPS ନମୁନା ପ୍ରସ୍ତୁତ କରାଯାଇଥିଲା: ବଫର୍ ଏବଂ ଏକ୍ସଟ୍ରୁଜନ୍ ମିଶ୍ରିତ ହୋଇଥିଲା ଏବଂ 1 ମିଟର ଟ୍ରାଇସ୍ (2-କାର୍ବକ୍ସାଇଥାଇଲ୍) ଫସଫାଇନ୍ (TCEP, କାର୍ବୋସିନ୍ଥ, କମ୍ପପଟନ୍, ୟୁକେ), 1 ମିଏମ୍ 2,2,2,2- (ଇଥାନ- 1, 2-ଡାଏଲଡିନିଟ୍ରିଲ୍) ଟେଟ୍ରାଏସେଟିକ୍ ଏସିଡ୍ (EDTA, କାର୍ବକ୍ସିନ୍ଥ) ଏବଂ 1% ପ୍ରୋଟିଜ୍ ଇନହିବିଟରର ମିଶ୍ରଣ (PMSF 100 mM, benzimide 1 mM, leupeptin 5 μM) |ତା’ପରେ αS ଏବଂ ଫ୍ୟୁଜ୍ ପଲିକେସନ୍ (ବିକଳ୍ପ pLK କିମ୍ବା Tau) ଯୋଡା ଯାଇଛି |ଥିଓଫ୍ଲାଭିନ୍-ଟି ଟାଇମ୍ ସିରିଜ୍ ପରୀକ୍ଷଣ ପାଇଁ (ThT, Carbosynth, Compton, UK), ସମୁଦାୟ ThT ଏକାଗ୍ରତାକୁ ଅଧା αS ଏକାଗ୍ରତା ଭାବରେ ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ |ନମୁନାଗୁଡିକ ଧୀରେ ଧୀରେ କିନ୍ତୁ ଭଲ ଭାବରେ ମିଶ୍ରଣ କରନ୍ତୁ ଯେ ସେମାନେ ଏକ ଅଟନ୍ତି |ଫଳାଫଳ ବିଭାଗରେ ବର୍ଣ୍ଣନା କରାଯାଇଥିବା ପରି ପ୍ରତ୍ୟେକ ଉପାଦାନର ଏକାଗ୍ରତା ପରୀକ୍ଷଣରୁ ପରୀକ୍ଷଣ ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ ଭିନ୍ନ ଥିଲା |ଯେତେବେଳେ ପରୀକ୍ଷଣର ଅବଧି 4 ଘଣ୍ଟା ଅତିକ୍ରମ କଲା, ଆଜାଇଡ୍ 0.02% (w / v) ର ଏକାଗ୍ରତାରେ ବ୍ୟବହୃତ ହେଲା |LLPS ନମୁନା ବ୍ୟବହାର କରି ସମସ୍ତ ବିଶ୍ଳେଷଣ ପାଇଁ, ମିଶ୍ରଣକୁ ବିଶ୍ଳେଷଣର 5 ମିନିଟ୍ ପୂର୍ବରୁ ସନ୍ତୁଳନ କରିବାକୁ ଅନୁମତି ଦିଅନ୍ତୁ |ହାଲୁକା ବିଛାଇବା ବିଶ୍ଳେଷଣ ପାଇଁ, 150 µl ନମୁନାଗୁଡିକ ଅଣ-ବାନ୍ଧୁଥିବା 96-କୂଅ ମାଇକ୍ରୋପ୍ଲେଟ୍ ଉପରେ ଧାରଣ କରାଯାଇଥିଲା (le କ୍ଲିୟର, କଳା, ଏଫ୍-ବଟମ୍ / ଚିମନି ୱେଲ, ଗ୍ରେନର୍ ବାୟୋ-ୱାନ୍, କ୍ରେମସ୍ମୁନ୍ଷ୍ଟର୍, ଅଷ୍ଟ୍ରିଆ) ଏବଂ ଆଡେସିଭ୍ ଫିଲ୍ମରେ ଆବୃତ କରାଯାଇଥିଲା |ଏକ CLARIOstar ପ୍ଲେଟ୍ ରିଡର୍ (BMG Labtech, Ortenberg, Germany) ରେ ସମାଧାନର କେନ୍ଦ୍ରରେ 350 nm ରେ ଅବଶୋଷଣ ମାପ କରି LLP ଗୁଡିକ ଉପରେ ନଜର ରଖାଯାଇଥିଲା |ପରୀକ୍ଷଣଗୁଡିକ ତ୍ରିଗୁଣରେ 25 ° C ରେ କରାଯାଇଥିଲା, ଏବଂ ତ୍ରୁଟିଗୁଡିକ ହାରାହାରି ଷ୍ଟାଣ୍ଡାର୍ଡ ବିଚ୍ୟୁତି ଭାବରେ ଗଣନା କରାଯାଇଥିଲା |ନମୁନା ସେଣ୍ଟ୍ରିଫୁଗେସନ୍ ଏବଂ SDS-PAGE ଜେଲ୍ ବିଶ୍ଳେଷଣ ଦ୍ The ାରା ମିଶ୍ରିତ ପର୍ଯ୍ୟାୟକୁ ପରିମାଣ କରାଯାଇଥିଲା, ଏବଂ ବିଭିନ୍ନ LLPS ସମାଧାନରେ ମିଶ୍ରିତ ଏବଂ ଏକାଗ୍ର ପର୍ଯ୍ୟାୟରେ αS ଭଗ୍ନାଂଶ ପରିମାଣ କରାଯାଇଥିଲା |1 μM AF488- ଲେବଲ୍ αS ଧାରଣ କରିଥିବା 100 μl LLPS ନମୁନାକୁ ପୁଙ୍ଖାନୁପୁଙ୍ଖ ମିଶ୍ରଣ ଦ୍ୱାରା ପ୍ରସ୍ତୁତ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ପରେ 30 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ 9600 × g ରେ ସେଣ୍ଟ୍ରିଫୁଗେସନ୍ ଦ୍, ାରା ପ୍ରସ୍ତୁତ କରାଯାଇଥିଲା, ଯାହା ପରେ ସାଧାରଣତ prec ବର୍ଷା ଦୃଶ୍ୟମାନ ହେଉଥିଲା |ଅଲ ern କିକ ପଦାର୍ଥର ଶୀର୍ଷ 50 μl SDS-PAGE ଜେଲ୍ ବ୍ୟବହାର କରି ପ୍ରୋଟିନ୍ ପରିମାଣ ପାଇଁ ବ୍ୟବହୃତ ହୋଇଥିଲା |ଏକ ChemiDoc ଜେଲ୍ ଇମେଜିଙ୍ଗ୍ ସିଷ୍ଟମ୍ (ବାୟୋ-ରେଡ୍ ଲାବୋରେଟୋରୀ, ହର୍କ୍ୟୁଲସ୍, CA, ଯୁକ୍ତରାଷ୍ଟ୍ର) ବ୍ୟବହାର କରି AF488 ଫିଲ୍ଟର୍ ସହିତ ଗେଲ୍ ସ୍କାନ୍ କରାଯାଇଥିଲା କିମ୍ବା କୁମାସି ଦାଗ ସହିତ ଦାଗ ଦିଆଯାଇଥିଲା ଏବଂ ଉପଯୁକ୍ତ ଫିଲ୍ଟର୍ ସହିତ ଭିଜୁଆଲ୍ କରାଯାଇଥିଲା |ImageJ ସଂସ୍କରଣ 1.53i (ନ୍ୟାସନାଲ ଇନଷ୍ଟିଚ୍ୟୁଟ୍ ଅଫ୍ ହେଲ୍ଥ, ଯୁକ୍ତରାଷ୍ଟ୍ର) ବ୍ୟବହାର କରି ଫଳାଫଳ ହୋଇଥିବା ବ୍ୟାଣ୍ଡଗୁଡ଼ିକୁ ବିଶ୍ଳେଷଣ କରାଯାଇଥିଲା |ସମାନ ଫଳାଫଳ ସହିତ ଦୁଇଟି ଭିନ୍ନ ପରୀକ୍ଷଣରେ ନକଲରେ ଏହି ପରୀକ୍ଷଣ କରାଯାଇଥିଲା |
ସାଧାରଣତ ,, 150 μl ନମୁନାଗୁଡିକ ଅଣ-ବାନ୍ଧୁଥିବା 96-କୂଅ ମାଇକ୍ରୋପ୍ଲେଟ୍ ଉପରେ ପ୍ରୟୋଗ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ଏକ ଲାଇକା DMI6000B ଓଲଟା ମାଇକ୍ରୋସ୍କୋପ୍ (ଲାଇକା ମାଇକ୍ରୋ ସିଷ୍ଟମ୍, ୱେଟଜଲର୍, ଜର୍ମାନୀ) ରେ କୋଠରୀ ତାପମାତ୍ରାରେ ଭିଜୁଆଲ୍ କରାଯାଇଥିଲା |ସ୍ପଟ୍ ପରୀକ୍ଷଣ ପାଇଁ, µ-ସ୍ଲାଇଡ୍ ଆଞ୍ଜିଜେନେସିସ୍ ପ୍ଲେଟ୍ (ଇବିଡି ଜିଏମ୍ବିଏଚ୍, ଗ୍ରାଫେଲଫିଙ୍ଗ, ଜର୍ମାନୀ) କିମ୍ବା 96-କୂଅ ପଲିଷ୍ଟାଇରନ୍ ମାଇକ୍ରୋପ୍ଲେଟ୍ସ (କର୍ନିଙ୍ଗ କୋଷ୍ଟାର କର୍ପ।, ଆକ୍ଟନ୍, ମାସାଚୁସେଟ୍ସ) ମଧ୍ୟ ବ୍ୟବହୃତ ହୋଇଥିଲା |EL6000 ହାଲୋଜେନ୍ କିମ୍ବା ମର୍କୁରୀ ଧାତୁ ହାଲାଇଡ୍ ଲ୍ୟାମ୍ପଗୁଡିକ ଆଲୋକ ଉତ୍ସ ଭାବରେ ବ୍ୟବହୃତ ହୋଇଥିଲା (ଯଥାକ୍ରମେ BF / DIC ଏବଂ WF ଇମେଜିଙ୍ଗ୍ ପାଇଁ) |ଡବ୍ଲୁଏଚ୍ ମାଇକ୍ରୋସ୍କୋପି ପାଇଁ, ନମୁନା ଉପରେ ଆଲୋକକୁ ଧ୍ୟାନ ଦେବା ଏବଂ ଏହାକୁ ସଂଗ୍ରହ କରିବା ପାଇଁ ଏକ 40x ମ୍ୟାଗ୍ନିଫିକେସନ୍ ଏୟାର ଅବଜେକ୍ଟିଭ୍ (ଲାଇକା ମାଇକ୍ରୋ ସିଷ୍ଟମ୍, ଜର୍ମାନୀ) ବ୍ୟବହୃତ ହୋଇଥିଲା |AF488 ଏବଂ ThT ଲେବଲ୍ ନମୁନା ପାଇଁ, ଷ୍ଟାଣ୍ଡାର୍ଡ GFP ଫିଲ୍ଟର ସେଟ୍ ସହିତ ଫିଲ୍ଟର ଉତ୍ତେଜନା ଏବଂ ନିର୍ଗମନ ଯଥାକ୍ରମେ 460-500 nm ଏବଂ 512–542 nm ବ୍ୟାଣ୍ଡପାସ୍ ଫିଲ୍ଟର୍ ଏବଂ 495 nm ଡିକ୍ରିକ୍ ଦର୍ପଣ |Atto647N ସହିତ ଲେବଲ୍ ହୋଇଥିବା ନମୁନାଗୁଡିକ ପାଇଁ, ଉତ୍ତେଜନା ଏବଂ ନିର୍ଗମନ ବ୍ୟାଣ୍ଡପାସ୍ ଫିଲ୍ଟର୍ ସହିତ ଯଥାକ୍ରମେ 628-40 nm ଏବଂ 692-40 nm ଏବଂ ଏକ 660 nm ଡିକ୍ରୋକ୍ ଦର୍ପଣ ସହିତ Cy5 ଫିଲ୍ଟରର ଏକ ମାନକ ସେଟ୍ ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇଥିଲା |BF ଏବଂ DIC ମାଇକ୍ରୋସ୍କୋପି ପାଇଁ, ସମାନ ପ୍ରତିଫଳିତ ଆଲୋକ ସଂଗ୍ରହ ଉଦ୍ଦେଶ୍ୟ ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ |ସଂଗୃହିତ ଆଲୋକ ଏକ ଲାଇକା DFC7000 ସିସିଡି କ୍ୟାମେରାରେ ରେକର୍ଡ କରାଯାଇଥିଲା (ଲାଇକା ମାଇକ୍ରୋ ସିଷ୍ଟମ, ଜର୍ମାନୀ) |ଏକ୍ସପୋଜର ସମୟ BF ଏବଂ DIC ମାଇକ୍ରୋସ୍କୋପି ଇମେଜିଙ୍ଗ ପାଇଁ 50 ମିସ ଏବଂ WF ମାଇକ୍ରୋସ୍କୋପି ଇମେଜିଙ୍ଗ ପାଇଁ 20-100 ମି।ତୁଳନା ପାଇଁ, ThT ସହିତ ସମସ୍ତ ପରୀକ୍ଷଣ ପାଇଁ ଏକ୍ସପୋଜର ସମୟ 100 ମି।ଡ୍ରପଲେଟ୍ କୋଏଲେସେନ୍ସକୁ ଭିଜୁଆଲ୍ କରିବା ପାଇଁ ଟାଇମ୍-ଲାପ୍ ପରୀକ୍ଷଣ କରାଯାଇଥିଲା, ପ୍ରତି 100 ମି। ପ୍ରତି ମିନିଟ୍ ପାଇଁ ପ୍ରତିଛବି ସଂଗ୍ରହ କରାଯାଉଥିଲା |ପ୍ରତିଛବି ବିଶ୍ଳେଷଣ ପାଇଁ ImageJ (NIH, USA) ବ୍ୟବହୃତ ହୋଇଥିଲା |ସମାନ ଫଳାଫଳ ସହିତ ତ୍ରିଗୁଣରେ ପରୀକ୍ଷଣ କରାଯାଇଥିଲା |
କୋଲୋକାଲାଇଜେସନ୍ ପରୀକ୍ଷଣ, FRAP ଏବଂ 3D ପୁନ struction ନିର୍ମାଣ ପାଇଁ, ZEN 2 ନୀଳ ସଂସ୍କରଣ (କାର୍ଲ ଜେସ୍ ଏଜି, ଓବରକୋଚେନ୍, ଜର୍ମାନୀ) ବ୍ୟବହାର କରି ଏକ Zeiss LSM 880 ଓଲଟା କନଫୋକାଲ୍ ମାଇକ୍ରୋସ୍କୋପ୍ ଉପରେ ଚିତ୍ରଗୁଡ଼ିକ ଅର୍ଜନ କରାଯାଇଥିଲା |50 µl ର ନମୁନା µ-ସ୍ଲାଇଡ୍ ଆଞ୍ଜିଓଜେନେସିସ୍ ପେଟ୍ରି ଡିସ୍ (ଆଇବିଡି ଜିଏମ୍ବିଏଚ୍, ଗ୍ରୋଫେଲଫିଙ୍ଗ, ଜର୍ମାନୀ) ରେ ପ୍ରୟୋଗ କରାଯାଇଥିଲା, ଏକ ହାଇଡ୍ରୋଫିଲିକ୍ ପଲିମର (ibiTreat) ସହିତ ଚିକିତ୍ସିତ ହୋଇଥିଲା ଏବଂ 63 × ତେଲ ବୁଡାଇବା ଉଦ୍ଦେଶ୍ୟରେ (ପ୍ଲାନ୍-ଆପୋକ୍ରୋମାଟ୍ 63 × / NA 1.4 ତେଲ) ଲଗାଯାଇଥିଲା | DIC ରେ)ଚିତ୍ରଗୁଡିକ 458 nm, 488 nm, ଏବଂ 633 nm ଆର୍ଗନ୍ ଲେଜର ରେଖା ବ୍ୟବହାର କରି 0.26 µm / ପିକ୍ସେଲ ଏବଂ 470–600 nm, 493–628 nm ର ଉତ୍ତେଜନା ଏବଂ ନିର୍ଗମନ ଚିହ୍ନଟ ୱିଣ୍ଡୋ ପାଇଁ 8 µs / ପିକ୍ସେଲର ଏକ୍ସପୋଜର ସମୟ ସହିତ ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇଥିଲା | ଏବଂ ଯଥାକ୍ରମେ ThT, AF488 ଏବଂ Atto647N କୁ ଭିଜୁଆଲ୍ କରିବାକୁ 638–755 nm ବ୍ୟବହୃତ ହୋଇଥିଲା |FRAP ପରୀକ୍ଷଣ ପାଇଁ, ପ୍ରତ୍ୟେକ ନମୁନାର ସମୟ ସମାପ୍ତ ଫଟୋଗ୍ରାଫି ପ୍ରତି ସେକେଣ୍ଡରେ 1 ଫ୍ରେମରେ ରେକର୍ଡ କରାଯାଇଥିଲା |ସମାନ ଫଳାଫଳ ସହିତ କୋଠରୀ ତାପମାତ୍ରାରେ ତ୍ରିଗୁଣରେ ଏହି ପରୀକ୍ଷଣ କରାଯାଇଥିଲା |ଜେନ blue ନୀଳ ସଂସ୍କରଣ ସଫ୍ଟୱେୟାର (କାର୍ଲ ଜେସ ଏଜି, ଓବରକୋଚେନ୍, ଜର୍ମାନୀ) ବ୍ୟବହାର କରି ସମସ୍ତ ପ୍ରତିଛବି ବିଶ୍ଳେଷଣ କରାଯାଇଥିଲା |FRAP ବକ୍ରଗୁଡିକ ସ୍ ized ାଭାବିକ କରାଯାଇଥିଲା, ପ୍ଲଟ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ OriginPro 9.1 ବ୍ୟବହାର କରି Zen 2 ବ୍ୟବହାର କରି ପ୍ରତିଛବିରୁ ବାହାର କରାଯାଇଥିବା ତୀବ୍ରତା / ସମୟ ତଥ୍ୟ ସହିତ ଫିଟ୍ କରାଯାଇଥିଲା |ପୁନରୁଦ୍ଧାର ବକ୍ରଗୁଡିକ ଏକ ମୋନୋ-ଏକ୍ସପୋନ୍ସେନାଲ୍ ମଡେଲରେ ଫିଟ୍ ହୋଇଥିଲା, ଯାହା ଅଧିଗ୍ରହଣ ବ୍ଲିଚିଂ ପ୍ରଭାବ ପାଇଁ ହିସାବ କରିବାକୁ ଅତିରିକ୍ତ ଏକ୍ସପୋନ୍ସନାଲ୍ ଶବ୍ଦ ସହିତ ମଲିକୁଲାର ବିସ୍ତାର ପାଇଁ ହିସାବ କରିବାକୁ |ତା’ପରେ ଆମେ ନାମକରଣ ବ୍ଲିଚିଂ ବ୍ୟାଡ୍ୟୁସ୍ ଏବଂ କାଙ୍ଗ ଏଟ୍ ସମୀକରଣ ପରି ପୂର୍ବ ସ୍ଥିର ହୋଇଥିବା ପୁନରୁଦ୍ଧାର ଅଧା ଜୀବନ ବ୍ୟବହାର କରି D ଗଣନା କଲୁ |5 35 ଦର୍ଶାଯାଇଛି |
SS ର ଏକକ ସିଷ୍ଟାଇନ୍ ପ୍ରକାରଗୁଡିକ 4-ହାଇଡ୍ରୋକ୍ସି-2,2,6,6-ଟେଟ୍ରାମେଥାଇଲପାଇପରାଇଡାଇନ୍-ଏନ-ଅକ୍ସିଲ୍ (TEMPOL) 24 (TEMPOL-24-αS) ଏବଂ 122 (TEMPOL-122-αS) ସହିତ ସିନ୍ଥାଇଜ୍ ହୋଇଥିଲା | ଯଥାକ୍ରମେEPR ପରୀକ୍ଷଣ ପାଇଁ ସ୍ପିନ୍ ଲେବେଲିଂ, αS ଏକାଗ୍ରତା 100 μM ରେ ସ୍ଥିର ହୋଇଥିଲା ଏବଂ PEG ଏକାଗ୍ରତା 15% (w / v) |ବିଭିନ୍ନ ଏକୀକରଣ ଅବସ୍ଥା ପାଇଁ, αS: pLK ଅନୁପାତ 1:10 ଥିବାବେଳେ αS: tNt-Tau ଏବଂ αS: Tau441 ଅନୁପାତ 1: 1 ରେ ବଜାୟ ରହିଲା |ଭିଡ଼ର ଅନୁପସ୍ଥିତିରେ ଟାଇଟ୍ରେସନ୍ ପରୀକ୍ଷଣକୁ ବାନ୍ଧିବା ପାଇଁ, TEMPOL-122-αS 50 μM ରେ ରକ୍ଷଣାବେକ୍ଷଣ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ଏକାଗ୍ରତା ବୃଦ୍ଧିରେ ପଲିକେସନ୍ ଟାଇଟର୍ କରାଯାଇଥିଲା, ପ୍ରତ୍ୟେକ ଅବସ୍ଥା ପୃଥକ ଭାବରେ ପ୍ରସ୍ତୁତ |CW-EPR ମାପ ଏକ ବ୍ରୁକର୍ ELEXSYS E580 ଏକ୍ସ-ବ୍ୟାଣ୍ଡ ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରୋମିଟର ବ୍ୟବହାର କରି ଏକ ବ୍ରୁକର୍ ER4118 SPT-N1 ରେଜୋନେଟର ସହିତ ସଜାଯାଇଥିବା ମାଇକ୍ରୋୱେଭ୍ (SHF) ଫ୍ରିକ୍ୱେନ୍ସି ~ 9.7 GHz ରେ କାର୍ଯ୍ୟ କରାଯାଇଥିଲା |ତାପମାତ୍ରା 25 ° C ରେ ସ୍ଥିର କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ଏକ ତରଳ ନାଇଟ୍ରୋଜେନ୍ କ୍ରିଷ୍ଟାଟ ଦ୍ୱାରା ନିୟନ୍ତ୍ରିତ ହୋଇଥିଲା |4 ମେଗାୱାଟ ବିଦ୍ୟୁତ ଶକ୍ତି, 0.1 ମ.ଟି.ର ଏକ ମୋଡ୍ୟୁଲେସନ୍ ଏମ୍ପିଲିଟ୍ୟୁ ଏବଂ 100 kHz ର ଏକ ମୋଡ୍ୟୁଲେସନ୍ ଫ୍ରିକ୍ୱେନ୍ସିରେ ଏହି ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରା ମିଳିଥିଲା ​​|ନମୁନା ମଧ୍ୟରେ ସ୍ପିନ୍ ଏକାଗ୍ରତା ଏବଂ Tau441 କିମ୍ବା ΔNt-Tau (ମୂଳ ପ୍ରୋଟିନ୍ ସମାଧାନରେ ଉପସ୍ଥିତ) ଥିବା ନମୁନାରେ ଏଜେଣ୍ଟ ହ୍ରାସ କରିବାର ଅବଶିଷ୍ଟ ଏକାଗ୍ରତା ହେତୁ ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରାଲ୍ ତୀବ୍ରତା ସ୍ normal ାଭାବିକ ହୋଇଥିଲା |Matlab®67 ରେ ଲାଗୁ ହୋଇଥିବା Easyspin ସଫ୍ଟୱେର୍ (v। 6.0.0-dev.34) ବ୍ୟବହାର କରି କରାଯାଇଥିବା EPR ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରାଲ ମଡେଲିଂର ପରିଣାମ ସ୍ୱରୂପ g ର ଦିଆଯାଇଥିବା ମୂଲ୍ୟଗୁଡ଼ିକ ପ୍ରାପ୍ତ ହେଲା |ତଥ୍ୟକୁ ମଡେଲ କରିବା ପାଇଁ ଗୋଟିଏ / ଦୁଇଟି ଉପାଦାନ ଆଇସୋଟ୍ରୋପିକ୍ ମଡେଲ ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇଥିଲା |ସମସ୍ତ ସଙ୍କେତକୁ ସ୍ izing ାଭାବିକ କରିବା ପରେ, ଅବଶିଷ୍ଟଗୁଡିକ ସଂପୃକ୍ତ ପରୀକ୍ଷାମୂଳକ ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରମରୁ ପ୍ରତ୍ୟେକ ଅନୁକରଣକୁ ବାହାର କରି ଗଣନା କରାଯାଇଥିଲା |ଟାଇଟେସନ୍ ବିଶ୍ଳେଷଣକୁ ବାନ୍ଧିବା ପାଇଁ, ତୃତୀୟ ବ୍ୟାଣ୍ଡର ଆପେକ୍ଷିକ ତୀବ୍ରତା ସ୍ normal ାଭାବିକ EPR ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରମ୍ (IIII / III) ର ଦ୍ୱିତୀୟ ବ୍ୟାଣ୍ଡକୁ αS ରେ ପଲିକେସନ୍ ବାନ୍ଧିବା ଉପରେ ନଜର ରଖିବା ପାଇଁ ବ୍ୟବହୃତ ହେଲା |ବିଚ୍ଛିନ୍ନତା ସ୍ଥିର (Kd) ଆକଳନ କରିବାକୁ, ଫଳାଫଳ ବକ୍ର ଏକ ଆନୁମାନିକ ମଡେଲରେ n ସମାନ ଏବଂ ସ୍ independent ାଧୀନ ବନ୍ଧନ ସାଇଟଗୁଡିକ ଧାରଣ କରି ଫିଟ୍ ହେଲା |
NMR ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରସ୍କୋପି ପରୀକ୍ଷଣ ଏକ ବ୍ରୁକର ନିଓ 800 MHz (1H) NMR ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରୋମିଟର ବ୍ୟବହାର କରି କ୍ରାଇପ୍ରୋବ ଏବଂ Z- ଗ୍ରେଡିଏଣ୍ଟ ସହିତ ସଜାଯାଇଥିଲା |ସମସ୍ତ ପରୀକ୍ଷଣଗୁଡିକ 130–207 µM αS ଏବଂ ଅନୁରୂପ αS / ΔNt-Tau ଏବଂ pLK ସମାନତା 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10% DO, pH 7.4 ବ୍ୟବହାର କରି କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ 15 ° C ରେ କରାଯାଇଥିଲା |NMR ଦ୍ L ାରା LPS ଉପରେ ନଜର ରଖିବା ପାଇଁ, ପୂର୍ବରୁ ମିଶ୍ରିତ ନମୁନାରେ 10% PEG ଯୋଗ କରାଯାଇଥିଲା |ରାସାୟନିକ ଶିଫ୍ଟ ପର୍ଟର୍ବେସନ୍ ପ୍ଲଟ୍ (ଚିତ୍ର 1 ବି) ହାରାହାରି 1H ଏବଂ 15N ରାସାୟନିକ ଶିଫ୍ଟ ଦେଖାଏ |ପୂର୍ବ ଆସାଇନମେଣ୍ଟ (BMRB ଏଣ୍ଟ୍ରି # 25227) ଉପରେ ଆଧାର କରି αS 2D1H-15N HSQC ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରା ନ୍ୟସ୍ତ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ HNCA, HNCO ଏବଂ CBCAcoNH ର 3D ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରାକୁ ରେକର୍ଡିଂ ଏବଂ ବିଶ୍ଳେଷଣ କରି ନିଶ୍ଚିତ କରାଯାଇଥିଲା |13Cα ଏବଂ 13Cβ ରାସାୟନିକ ପରିବର୍ତ୍ତନଗୁଡିକ tNt-Tau କିମ୍ବା pLK ର ଉପସ୍ଥିତିରେ ଗଣନା କରାଯାଇଥିଲା ଯାହା ଦ୍ pure ିତୀୟ ସଂରଚନା ଧାରାରେ ସମ୍ଭାବ୍ୟ ପରିବର୍ତ୍ତନଗୁଡିକ ମାପିବା ପାଇଁ ଶୁଦ୍ଧ ରାଣ୍ଡମ କୋଇଲ୍ ରୂପାନ୍ତରଣରେ αS ରାସାୟନିକ ପରିବର୍ତ୍ତନ ତୁଳନାରେ 68 (ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 5c) |8, 36, 76, 100, 156, 250, 400, ଏବଂ 800 ମିସ ବିଳମ୍ବ ସହିତ hsqctretf3gpsi ପରୀକ୍ଷଣ (ବ୍ରୁକର ଲାଇବ୍ରେରୀରୁ ପ୍ରାପ୍ତ) ରେକର୍ଡିଂ କରି R1ρ ହାର ମାପ କରାଯାଇଥିଲା, ଏବଂ ଏକ୍ସପୋନ୍ସନାଲ ଫଙ୍କସନ୍ଗୁଡ଼ିକ ବିଭିନ୍ନ ସମୟରେ ଶିଖର ତୀବ୍ରତା ବିଳମ୍ବରେ ନିୟନ୍ତ୍ରିତ ହୋଇଥିଲା | R1ρ ଏବଂ ଏହାର ପରୀକ୍ଷାମୂଳକ ଅନିଶ୍ଚିତତା ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରିବାକୁ ସମୟ |
ଦୁଇ ରଙ୍ଗର ସମୟ ସମାଧାନ ହୋଇଥିବା ଫ୍ଲୋରୋସେନ୍ସ ମାଇକ୍ରୋସ୍କୋପି ପରୀକ୍ଷଣଗୁଡିକ ଏକ ବ୍ୟବସାୟିକ ସମୟ ସମାଧାନ ହୋଇଥିବା MT200 ଫ୍ଲୋରୋସେନ୍ସ କନଫୋକାଲ ମାଇକ୍ରୋସ୍କୋପ୍ (ପିକୋ କ୍ୱାଣ୍ଟ, ବର୍ଲିନ୍, ଜର୍ମାନୀ) ସହିତ ସମୟ ସହ ଜଡିତ ଏକକ ଫୋଟନ୍ ଗଣନା (TCSPC) ଉପକରଣ ସହିତ କରାଯାଇଥିଲା |ଲେଜର ଡାୟୋଡ୍ ହେଡ୍ ପଲ୍ସଡ୍ ଇଣ୍ଟରଲିଭେଡ୍ ଉତ୍ତେଜନା (PIE) ପାଇଁ ବ୍ୟବହୃତ ହୁଏ, ବିମ୍ ଏକ ମୋଡ୍ ୱେଭଗାଇଡ୍ ଦେଇ ଯାଇଥାଏ ଏବଂ 481 nm ପାଇଁ 10 ରୁ 100 nW ର ଏକ ଲେଜର ଶକ୍ତି ଏବଂ 637 nm ଲେଜର ଲାଇନଗୁଡିକ ଏକ ଡିକ୍ରିକ୍ ଦର୍ପଣ ପରେ ମାପ କରାଯାଇଥାଏ |ଫୋଟନ୍ ଛଦ୍ମନାମ, ଫୋଟୋବ୍ଲିଚିଂ ଏବଂ ସାଚୁରେଚରର ପ୍ରଭାବକୁ ଏଡାଇ ଏହା ଏକ ଉତ୍କୃଷ୍ଟ ଫୋଟନ୍ ଗଣନା ହାରକୁ ସୁନିଶ୍ଚିତ କରେ |μ- ସ୍ଲାଇଡ୍ ଆଞ୍ଜିଓଜେନେସିସ୍ କଭର୍ଲିପ୍ସ କିମ୍ବା ପ୍ଲେଟଗୁଡିକ (ଆଇବିଡି ଜିଏମ୍ବିଏଚ୍, ଗ୍ରାଫେଲଫିଙ୍ଗ, ଜର୍ମାନୀ) ଏକ ସୁପର୍ ଆପୋକ୍ରୋମାଟ୍ 60x NA 1.2 ଲେନ୍ସ ଉପରେ ଏକ ସଂଶୋଧନ କଲର (ଅଲିମ୍ପସ୍ ଲାଇଫ୍ ସାଇନ୍ସ, ୱାଲ୍ଟାମ, ଯୁକ୍ତରାଷ୍ଟ୍ର) ଉପରେ ସିଧାସଳଖ ବୁଡ଼ ପକାଇବା ପାଣିରେ ରଖାଯାଇଥିଲା |ମୁଖ୍ୟ ବିମ୍ ସ୍ପ୍ଲିଟର ଭାବରେ ଏକ 488/640 nm ଡିକ୍ରିକ୍ ଦର୍ପଣ (ସେମ୍ରକ୍, ହ୍ରଦ ବନ, ଆଇଏଲ୍, ଯୁକ୍ତରାଷ୍ଟ୍ର) ବ୍ୟବହୃତ ହୋଇଥିଲା |ଅବ୍ୟବହୃତ ବିକିରଣ 50 ମାଇକ୍ରନ୍ ବ୍ୟାସ ବିଶିଷ୍ଟ ଏକ ଛିଦ୍ର ଦ୍ୱାରା ଅବରୋଧିତ ହୁଏ, ତା’ପରେ ଫୋକସ୍ ବିକିରଣକୁ 50/50 ବିମ୍ ସ୍ପ୍ଲିଟର ଦ୍ୱାରା 2 ଚିହ୍ନଟ ପଥରେ ବିଭକ୍ତ କରାଯାଏ |ଡିଟେକ୍ଟର ସାମ୍ନାରେ ବ୍ୟାଣ୍ଡପାସ୍ ନିର୍ଗମନ ଫିଲ୍ଟରଗୁଡିକ (ସେମ୍ରକ୍, ହ୍ରଦ ବନ, ଆଇଏଲ୍, ଯୁକ୍ତରାଷ୍ଟ୍ର) 520/35 ସବୁଜ ରଙ୍ଗ (AF488) ଏବଂ ଲାଲ ରଙ୍ଗ ପାଇଁ 690/70 ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇଥିଲା |ସିଙ୍ଗଲ୍-ଫୋଟନ୍ ଆଭାଲାନଚ ଡାୟୋଡ୍ (SPAD) (ମାଇକ୍ରୋ ଫୋଟନ୍ ଡିଭାଇସ୍, ବୋଲଜାନୋ, ଇଟାଲୀ) ଡିଟେକ୍ଟର ଭାବରେ ବ୍ୟବହୃତ ହେଉଥିଲା |ବାଣିଜ୍ୟିକ ଭାବରେ ଉପଲବ୍ଧ SymphoTime64 ସଫ୍ଟୱେର୍ (PicoQuant GmbH, ବର୍ଲିନ୍, ଜର୍ମାନୀ) ବ୍ୟବହାର କରି ଉଭୟ ତଥ୍ୟ ସଂଗ୍ରହ ଏବଂ ବିଶ୍ଳେଷଣ କରାଯାଇଥିଲା |
LLPS ନମୁନାଗୁଡିକର ପଚାଶ ମାଇକ୍ରୋଲାଇଟର μ- ସ୍ଲାଇଡ୍ ଆଞ୍ଜିଜେନେସିସ୍ କୂଅରେ ପ୍ରୟୋଗ କରାଯାଇଥିଲା (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Germany) |ନିଲମ୍ବିତ ବୁନ୍ଦା ପାଇଁ ଉତ୍କୃଷ୍ଟ ଅବଜେକ୍ଟିଭ୍ କାର୍ଯ୍ୟ ଦୂରତା ପାଇଁ ଏବଂ ରାଫ୍ଟ ଏବଂ ବିନ୍ଦୁ ପାଇଁ ଅତିକମରେ 0.25 µm / ପିକ୍ସେଲର ଅକ୍ଷୀୟ ରିଜୋଲ୍ୟୁସନ୍ ଏବଂ 400 µs / ପିକ୍ସେଲର ବିଳମ୍ବ ସମୟ ସହିତ ଫଳାଫଳ ପ୍ରତିଛବିଗୁଡିକ କୂଅର ତଳରୁ 20 µm ଉପରେ ଧ୍ୟାନ ଦିଆଯାଇଛି |ପ୍ରତ୍ୟେକ ଚ୍ୟାନେଲ ପାଇଁ ହାରାହାରି ପୃଷ୍ଠଭୂମି ସଙ୍କେତ ତୀବ୍ରତା (ପିବିଜି, ଅର୍ଥ + 2σ) ଉପରେ ଆଧାର କରି ଏକ ତୀବ୍ରତା ସୀମା ପ୍ରୟୋଗ କରି ତଥ୍ୟ ଚୟନ କରନ୍ତୁ ଯାହା ଦ୍ only ାରା କେବଳ ତରଳ ପ୍ରୋଟିନ୍ ବୁନ୍ଦା, ରାଫ୍ଟ, କିମ୍ବା ଦାଗଗୁଡିକ ମନୋନୀତ ହୋଇ ବିଛିନ୍ନ ପର୍ଯ୍ୟାୟରେ କ possible ଣସି ସମ୍ଭାବ୍ୟ ଉତ୍ପତ୍ତି ଫିଲ୍ଟର୍ କରାଯାଇଥାଏ |ପ୍ରତ୍ୟେକ ଚ୍ୟାନେଲର ପ୍ରତ୍ୟେକ ପ୍ରଜାତିର (τ) ଜୀବନକାଳ (AF488 ପାଇଁ ସବୁଜ, “g” ଏବଂ Atto647N ପାଇଁ “r”) ବିଶ୍ଳେଷଣ କରିବାକୁ, ଆମେ ବୁନ୍ଦା, ରାଫ୍ଟ, କିମ୍ବା ଦାଗ ଧାରଣ କରିଥିବା ଆଗ୍ରହର ଅଞ୍ଚଳ (ROI) ଚୟନ କରିଛୁ (ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 1 | )8b) ଏବଂ ସେମାନଙ୍କ ଜୀବନବ୍ୟାପୀ କ୍ଷୟ (τD, τR ଏବଂ ଡ୍ରପଲେଟ୍, ରାଫ୍ଟ କିମ୍ବା ସ୍ପଟ୍ ପାଇଁ τP ଯଥାକ୍ରମେ ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 8c ଦେଖନ୍ତୁ) ଏକ ଟେଲ-ଫିଟ୍ ବିଶ୍ଳେଷଣ ଏବଂ ଦୁଇ-ଉପାଦାନ କ୍ଷୟ ମଡେଲ୍ ବ୍ୟବହାର କରି ସେଗୁଡିକୁ ପ୍ରାପ୍ତ କଲେ |Τ ରୁ ହାରାହାରି τଏକ ମଲ୍ଟି-ଏକ୍ସପୋନ୍ସେନାଲ୍ ଫିଟ୍ ପାଇଁ ବହୁତ କମ୍ ଫୋଟନ୍ ଉତ୍ପାଦନ କରୁଥିବା ROI ବିଶ୍ଳେଷଣରୁ ବାଦ ଦିଆଗଲା |ବ୍ୟବହୃତ କଟଅଫ୍ ହେଉଛି ରାଫ୍ଟ ଏବଂ ବିନ୍ଦୁ ପାଇଁ 104 ଫୋଟନ୍ ଏବଂ ଡ୍ରପ୍ ପାଇଁ 103 |ବୁନ୍ଦାମାନଙ୍କର ଏକ କମ୍ ସୀମା ଅଛି କାରଣ ଅଧିକ ତୀବ୍ରତା ମୂଲ୍ୟ ସହିତ କ୍ଷୟ ବକ୍ର ପାଇବା କଷ୍ଟକର, ଯେହେତୁ ପ୍ରତିଛବି କ୍ଷେତ୍ରରେ ବୁନ୍ଦା ସାଧାରଣତ smaller ଛୋଟ ଏବଂ କମ୍ ସଂଖ୍ୟକ |ଫୋଟନ୍ ଗଣନା ସୀମା ଉପରେ ଥିବା ଫୋଟନ୍ ଗଣନା ସହିତ ROI ଗୁଡିକ (500 କାଉଣ୍ଟ୍ / ପିକ୍ସେଲରେ ସେଟ୍) ମଧ୍ୟ ବିଶ୍ଳେଷଣ ପାଇଁ ବର୍ଜନ କରାଯାଇଥିଲା |ସେବା ଜୀବନର ଆରମ୍ଭରୁ ସର୍ବନିମ୍ନ 90% (କ୍ଷୟର ସର୍ବାଧିକ ତୀବ୍ରତା ପରେ ସାମାନ୍ୟ) ଆଗ୍ରହର ଅଞ୍ଚଳରୁ ପ୍ରାପ୍ତ ତୀବ୍ରତା କ୍ଷୟ ବକ୍ରକୁ ମେଳ କରନ୍ତୁ, ସମସ୍ତ ତୀବ୍ରତା କ୍ଷୟ ପାଇଁ ସମାନ ବଜାୟ ରଖିବା ସହିତ ସର୍ବନିମ୍ନ IRF ହସ୍ତକ୍ଷେପ ନିଶ୍ଚିତ କରିବାକୁ | ସେଟିଙ୍ଗ୍ ଆପେକ୍ଷିକ ସମୟ ୱିଣ୍ଡୋ ରାଫ୍ଟ ଏବଂ ସ୍ପଟ୍ ପାଇଁ 25 ରୁ 50 ROI ଏବଂ ଡ୍ରପ୍ ପାଇଁ 15-25 ROI ବିଶ୍ଳେଷଣ କରାଯାଇଥିଲା, ଅତି କମରେ 3 ଟି ସ୍ independent ାଧୀନ ପରୀକ୍ଷଣରୁ ରେକର୍ଡ ହୋଇଥିବା 4 ରୁ ଅଧିକ ପ୍ରତିକୃତିରୁ ମନୋନୀତ ଚିତ୍ର |ପ୍ରଜାତି ମଧ୍ୟରେ କିମ୍ବା କୋକ୍ରେଭେଟ୍ ସିଷ୍ଟମ୍ ମଧ୍ୟରେ ପରିସଂଖ୍ୟାନିକ ପାର୍ଥକ୍ୟକୁ ଆକଳନ କରିବାକୁ ଦୁଇ-ଲାଞ୍ଜ ବିଶିଷ୍ଟ ଟି-ଟେଷ୍ଟ ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇଛି |ଆଜୀବନ (τ) ର ଏକ ପିକ୍ସେଲ-ବାଇ-ପିକ୍ସେଲ ବିଶ୍ଳେଷଣ ପାଇଁ, ପ୍ରତ୍ୟେକ ଚ୍ୟାନେଲ ପାଇଁ କ୍ଷେତ୍ର ଉପରେ ଆଜୀବନ ସମୁଦାୟ ଆଟେନ୍ସେସନ ଗଣନା କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ଏକ 2/3-ଉପାଦାନ ଏକ୍ସପୋନ୍ସନାଲ ଆଟେନୁଏସନ୍ ମଡେଲର ଏକ ଆନୁମାନିକ କାର୍ଯ୍ୟ କରାଯାଇଥିଲା |ପ୍ରତ୍ୟେକ ପିକ୍ସେଲ ପାଇଁ ଆଜୀବନ ଆଘାତ ପୂର୍ବରୁ ଗଣିତ τ ମୂଲ୍ୟ ବ୍ୟବହାର କରି ଫିଟ୍ ହୋଇଥିଲା, ଫଳସ୍ୱରୂପ ଏକ ଛଦ୍ମ ରଙ୍ଗର FLIM ଫିଟ୍ ଇମେଜ୍ |ସମାନ ଚ୍ୟାନେଲର ସମସ୍ତ ପ୍ରତିଛବିଗୁଡ଼ିକରେ ଲାଞ୍ଜ-ଫିଟ୍ ଜୀବନବ୍ୟାପୀ ସମାନ ଥିଲା ଏବଂ ପ୍ରତ୍ୟେକ କ୍ଷୟ ଏକ ନିର୍ଭରଯୋଗ୍ୟ ଫିଟ୍ ଯୋଗାଇବା ପାଇଁ ପର୍ଯ୍ୟାପ୍ତ ଫୋଟନ୍ ଉତ୍ପାଦନ କରିଥିଲା ​​|FRET ବିଶ୍ଳେଷଣ ପାଇଁ, 100 ଫୋଟନ୍ ର ନିମ୍ନ ତୀବ୍ରତା ସୀମା ପ୍ରୟୋଗ କରି ପିକ୍ସେଲଗୁଡିକ ଚୟନ କରାଯାଇଥିଲା, ଯାହା ହାରାହାରି 11 ଫୋଟନ୍ ର ପୃଷ୍ଠଭୂମି ସଙ୍କେତ (FBG) |ପ୍ରତ୍ୟେକ ଚ୍ୟାନେଲର ଫ୍ଲୋରୋସେନ୍ସ ତୀବ୍ରତା ପରୀକ୍ଷାମୂଳକ ଭାବରେ ନିର୍ଣ୍ଣୟ ସଂଶୋଧନ କାରକ ଦ୍ୱାରା ସଂଶୋଧିତ ହେଲା: 69 ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରାଲ କ୍ରସଷ୍ଟାଲ 0.004 0.004, ପ୍ରତ୍ୟକ୍ଷ ଉତ୍ତେଜନା 0.0 0.0305, ଚିହ୍ନଟ ଦକ୍ଷତା 0.517 ଥିଲା |ପିକ୍ସେଲ ସ୍ତରରେ FRET ଦକ୍ଷତା ତାପରେ ନିମ୍ନ ସମୀକରଣ ବ୍ୟବହାର କରି ଗଣନା କରାଯାଏ:
ଯେଉଁଠାରେ FDD ହେଉଛି ଦାତା (ସବୁଜ) ଚ୍ୟାନେଲରେ ଦେଖାଯାଉଥିବା ଫ୍ଲୋରୋସେନ୍ସ ତୀବ୍ରତା, FDA ହେଉଛି ପରୋକ୍ଷ ଉତ୍ତେଜନା ମଧ୍ୟରେ ଗ୍ରହଣକାରୀ (ଲାଲ) ଚ୍ୟାନେଲରେ ଦେଖାଯାଇଥିବା ଫ୍ଲୋରୋସେନ୍ସ ତୀବ୍ରତା, ଏବଂ FAA ହେଉଛି ଫ୍ଲୋରୋସେନ୍ସ ତୀବ୍ରତା ପ୍ରତ୍ୟକ୍ଷ ଉତ୍ତେଜନାରେ ଗ୍ରହଣକାରୀ (ଲାଲ) ଚ୍ୟାନେଲରେ ଦେଖାଯାଏ | PIE) |ଚ୍ୟାନେଲରେ ଫ୍ଲୋରୋସେନ୍ସ ତୀବ୍ରତା ଡାଲି ପାଳନ କରାଯାଏ) |
100 µl LLPS ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ସମାଧାନଗୁଡିକ 25 µM ଅବ୍ୟବହୃତ ମୋନୋମେରିକ୍ Tau441 (25 µM αS ସହିତ କିମ୍ବା ବିନା) LLPS ବଫର୍ (ଉପରୋକ୍ତ ପରି ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟ) ଧାରଣ କରି 96-କୂଅ ମାଇକ୍ରୋପ୍ଲେଟ୍ ଉପରେ ଆଡେସିଭ୍ ଫଏଲ୍ ଆବରଣ ଏବଂ ଡ୍ରପଲେଟ୍ ଗଠନ WF ମାଇକ୍ରୋସ୍କୋପି ଦ୍ୱାରା ଯାଞ୍ଚ କରାଯିବା ପରେ | ସନ୍ତୁଳନ10 ମିନିଟ୍ ମଧ୍ୟରେକୋଠରୀ ତାପମାତ୍ରାରେ 48 ଘଣ୍ଟା ଇନକ୍ୟୁବେସନ ପରେ ପ୍ରୋଟିନ୍ ରାଫ୍ଟ ଏବଂ ଦାଗର ଉପସ୍ଥିତି ନିଶ୍ଚିତ ହେଲା |ତାପରେ କୂଅରୁ ରାଫ୍ଟ ଉପରେ ଥିବା ତରଳ ପଦାର୍ଥକୁ ସାବଧାନତାର ସହିତ କା remove ି ଦିଅ, ତାପରେ 50 L ବିଚ୍ଛିନ୍ନତା ବଫର (10 MM HEPES, pH 7.4, 1 M NaCl, 1 mM DTT) ମିଶାନ୍ତୁ ଏବଂ 10 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ ଇନକ୍ୟୁବେଟ୍ କରନ୍ତୁ |ଅଧିକ ଲୁଣର ଏକାଗ୍ରତା ନିଶ୍ଚିତ କରେ ଯେ ଅବଶିଷ୍ଟ PEG କାରଣରୁ LLPS ପୁନରାବୃତ୍ତି ହେବ ନାହିଁ ଏବଂ କେବଳ ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋଷ୍ଟାଟିକ୍ ପାରସ୍ପରିକ କ୍ରିୟା ଦ୍ formed ାରା ଗଠିତ ସମ୍ଭାବ୍ୟ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଆସେମ୍ବଲିଗୁଡିକ ବିଛିନ୍ନ ହୋଇଯିବ |କୂଅର ତଳଟି ଏକ ମାଇକ୍ରୋପିପେଟ୍ ଟିପ୍ ସହିତ ଯତ୍ନର ସହିତ ସ୍କ୍ରାପ୍ ହୋଇଗଲା ଏବଂ ଫଳାଫଳଟି ଏକ ଖାଲି ପର୍ଯ୍ୟବେକ୍ଷଣ କୂଅକୁ ସ୍ଥାନାନ୍ତରିତ ହେଲା |1 ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ 50 μM ThT ସହିତ ନମୁନାଗୁଡିକର ଇନ୍କ୍ୟୁବେସନ ପରେ, WF ମାଇକ୍ରୋସ୍କୋପି ଦ୍ୱାରା ପୃଥକ ଦାଗଗୁଡିକର ଉପସ୍ଥିତି ଯାଞ୍ଚ କରାଯାଇଥିଲା |PH 7.4, ସୋଡିୟମ୍ ଆଜାଇଡ୍ 0.01% 37 ° C ଏବଂ ସୋଡିୟମ୍ ଆଜାଇଡ୍ 0.01% ଏବଂ 7 ଦିନ ପାଇଁ କକ୍ଷପଥରେ 200 rpm ସହିତ 300 µl 70-µM αS ସମାଧାନର 300 µl ଇନ୍କ୍ୟୁବେନ୍ କରି ସୋନିକେଟ୍ αS ଫାଇବ୍ରିଲ୍ ପ୍ରସ୍ତୁତ କରନ୍ତୁ |ଏହାର ସମାଧାନ ପରେ 30 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ 9600 × g ରେ ସେଣ୍ଟ୍ରିଫୁଗ୍ କରାଯାଇଥିଲା, ପେଲେଟକୁ PBS pH 7.4 ରେ ପୁନ us ପଠାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ସୋନିକେଟ୍ କରାଯାଇଥିଲା (1 ମିନିଟ୍, 50% ଚକ୍ର, ଏକ ଭିବ୍ରା-ସେଲ୍ VC130 ସୋନିକେଟର୍, ସୋନିକ୍ସ, ନ୍ୟୁଟନ୍, ଯୁକ୍ତରାଷ୍ଟ୍ର) ଫାଇବ୍ରିଲ୍ ନମୁନାରେ | ଛୋଟ ଫାଇବ୍ରିଲଗୁଡ଼ିକର ଅପେକ୍ଷାକୃତ ସମାନ ଆକାର ବଣ୍ଟନ ସହିତ |
PIE ମୋଡ୍ ବ୍ୟବହାର କରି FLIM-FRET ମାଇକ୍ରୋସ୍କୋପି ପରୀକ୍ଷଣ ପାଇଁ ବ୍ୟବହୃତ ସମାନ MT200 ସମୟ ସମାଧାନ ହୋଇଥିବା ଫ୍ଲୋରୋସେଣ୍ଟ୍ କନଫୋକାଲ୍ ମାଇକ୍ରୋସ୍କୋପ୍ (ପିକୋ-କ୍ୱାଣ୍ଟ, ବର୍ଲିନ୍, ଜର୍ମାନୀ) ରେ FCS / FCCS ବିଶ୍ଳେଷଣ ଏବଂ ଦୁଇ ରଙ୍ଗର ସମକକ୍ଷ ଚିହ୍ନଟ (TCCD) କରାଯାଇଥିଲା |ଏହି ପରୀକ୍ଷଣଗୁଡିକ ପାଇଁ ଲେଜର ଶକ୍ତି 6.0 µW (481 nm) ଏବଂ 6.2 µW (637 nm) ରେ ଯୋଗ କରାଯାଇଥିଲା |ଏହି ଲେଜର ଶକ୍ତିଗୁଡିକର ମିଶ୍ରଣକୁ ସର୍ବୋତ୍କୃଷ୍ଟ ଗଣନା ହାର ହାସଲ କରିବା ଏବଂ ଫୋଟୋବ୍ଲେଚିଂ ଏବଂ ସାଚୁଚରେସନ୍ ଠାରୁ ଦୂରେଇ ରହିବା ସମୟରେ ବ୍ୟବହୃତ ଫ୍ଲୋରୋଫୋର ଯୁଗଳ ପାଇଁ ସମାନ ଉଜ୍ଜ୍ୱଳତା ସୃଷ୍ଟି କରିବାକୁ ଚୟନ କରାଯାଇଥିଲା |ଉଭୟ ତଥ୍ୟ ସଂଗ୍ରହ ଏବଂ ବିଶ୍ଳେଷଣ ବାଣିଜ୍ୟିକ ଭାବରେ ଉପଲବ୍ଧ SymphoTime64 ସଂସ୍କରଣ 2.3 ସଫ୍ଟୱେର୍ (PicoQuant, ବର୍ଲିନ୍, ଜର୍ମାନୀ) ବ୍ୟବହାର କରି କରାଯାଇଥିଲା |
LLPS ବ୍ୟବହାର କରି ପ୍ରାପ୍ତ ବିଚ୍ଛିନ୍ନ αS / Tau ଏଗ୍ରିଗେଟଗୁଡିକର ନମୁନାଗୁଡିକ ଉପଯୁକ୍ତ ମୋନୋମୋଲ୍ୟୁକୁଲାର ଏକାଗ୍ରତାକୁ ପୃଥକ ବଫରରେ ମିଶ୍ରିତ କରାଯାଏ (ସାଧାରଣତ a 1: 500 ମିଶ୍ରଣ, ଯେହେତୁ ଏକତ୍ରିକରଣ ନମୁନାରୁ ପୃଥକ ହେବା ସମୟରେ ଏଗ୍ରିଗେଟ୍ ଗୁଡିକ କମ୍ ଏକାଗ୍ରତାରେ ଥାଏ) |1 ମିଗ୍ରା / ଏମଏଲ୍ ଏକାଗ୍ରତାରେ BSA ସମାଧାନ ସହିତ ପ୍ରସ୍ତୁତ କଭର୍ଲିପ୍ସ (କର୍ନିଙ୍ଗ, ଯୁକ୍ତରାଷ୍ଟ୍ର) ରେ ନମୁନାଗୁଡିକ ସିଧାସଳଖ ପ୍ରୟୋଗ କରାଯାଇଥିଲା |
ସବୁଜ ଏବଂ ନାଲି ଚ୍ୟାନେଲଗୁଡିକରେ PIE-smFRET ବିଶ୍ଳେଷଣ ପାଇଁ, ମୋନୋମେରିକ୍ ଇଭେଣ୍ଟଗୁଡିକ ଦ୍ caused ାରା ସୃଷ୍ଟି ହୋଇଥିବା ନିମ୍ନ ତୀବ୍ରତା ସଙ୍କେତଗୁଡିକ ଫିଲ୍ଟର୍ କରିବା ପାଇଁ 25 ଫୋଟନ୍ ର ଏକ ନିମ୍ନ ତୀବ୍ରତା ସୀମା ପ୍ରୟୋଗ କରାଯାଇଥିଲା (ଧ୍ୟାନ ଦିଅନ୍ତୁ ଯେ ମୋନୋମର୍ସ ପୃଥକ ଏଗ୍ରିଗେଟ୍ ତୁଳନାରେ ଏକତ୍ରିତ ନମୁନାଠାରୁ ଅଧିକ) |ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ଭାବରେ ବିଶ୍ଳେଷଣ ପାଇଁ ଏଗ୍ରିଗେଟ୍ ବାଛିବା ପାଇଁ ଶୁଦ୍ଧ ମୋନୋମର ନମୁନା ବିଶ୍ଳେଷଣରୁ ପ୍ରାପ୍ତ ମୋନୋମେରିକ୍ αS ର ହାରାହାରି ତୀବ୍ରତାର ପାଞ୍ଚ ଗୁଣ ହିସାବ କରାଯାଇଥିଲା |PIE ଡ୍ରାଇଭ୍ ସର୍କିଟ୍, TSCPC ଡାଟା ଅଧିଗ୍ରହଣ ସହିତ, ଏକ ଆଜୀବନ ଓଜନ ଫିଲ୍ଟରର ପ୍ରୟୋଗକୁ ସକ୍ଷମ କରିଛି ଯାହା ପୃଷ୍ଠଭୂମି ଏବଂ ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରାଲ୍ କ୍ରସ୍ଷ୍ଟାଲ୍କୁ ଦୂର କରିବାରେ ସାହାଯ୍ୟ କରେ |ଉପରୋକ୍ତ ଥ୍ରେସହୋଲ୍ଡଗୁଡିକ ବ୍ୟବହାର କରି ମନୋନୀତ ଜ୍ .ରର ତୀବ୍ରତା କେବଳ ବଫର୍-ନମୁନାଗୁଡ଼ିକର ଘଟଣାର ହିଷ୍ଟୋଗ୍ରାମ୍ ବନାମ ହିଷ୍ଟୋଗ୍ରାମ୍ ରୁ ନିର୍ଦ୍ଧିଷ୍ଟ ହାରାହାରି ପୃଷ୍ଠଭୂମି ସଙ୍କେତ ବ୍ୟବହାର କରି ସଂଶୋଧିତ ହେଲା |ବୃହତ ଏଗ୍ରିଗେଟ୍ ସହିତ ଜଡିତ ବିସ୍ଫୋରଣଗୁଡିକ ସାଧାରଣତ time ଟାଇମ୍ ଟ୍ରେସରେ କ୍ରମାଗତ ଅନେକ ବିନ୍ ଦଖଲ କରେ (1 ମି। ସେଟ୍) |ଏହି କ୍ଷେତ୍ରରେ, ସର୍ବାଧିକ ଶକ୍ତିର ଏକ ବିନ୍ ଚୟନ କରାଯାଇଥିଲା |FRET ଏବଂ stoichiometric ବିଶ୍ଳେଷଣ ପାଇଁ, ତତ୍ତ୍ୱଗତ ଭାବରେ ନିର୍ଣ୍ଣୟ ହୋଇଥିବା ଗାମା ଫ୍ୟାକ୍ଟର୍ γ (0.517) ବ୍ୟବହୃତ ହେଲା |ବ୍ୟବହୃତ ଉତ୍ତେଜନା ଲେଜର ଶକ୍ତିରେ ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରାଲ୍ କ୍ରସ୍ଷ୍ଟାଲ୍ ଏବଂ ସିଧାସଳଖ ଉତ୍ତେଜନା ଅବଦାନ ଅବହେଳିତ (ପରୀକ୍ଷାମୂଳକ ଭାବେ ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରାଯାଏ) |ବିସ୍ଫୋରଣରେ FRET ର ଦକ୍ଷତା ଏବଂ ଷ୍ଟୋଇଚିଓମେଟ୍ରୀକୁ ନିମ୍ନଲିଖିତ ଭାବରେ ଗଣନା କରାଯାଏ |